Geração de Cybrid Transmitochondrial Usando Linhas de Células Cancerígenas

Ruth Soler-Agesta; Joaquín Marco-Brualla; Patricio Fernández-Silva; Pilar Mozas; Alberto Anel; Raquel Moreno Loshuertos

doi:10.3791/65186

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Artigo de método

Geração de Cybrid Transmitochondrial Usando Linhas de Células Cancerígenas

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DOI:

10.3791/65186

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17 de março de 2023

Ruth Soler-Agesta¹ , Joaquín Marco-Brualla¹ , Patricio Fernández-Silva¹^,² , Pilar Mozas¹^,³ , Alberto Anel¹ , Raquel Moreno Loshuertos¹^,²

¹Department of Biochemistry, University of Zaragoza, ²Institute for Biocomputation and Physics of Complex Systems, University of Zaragoza, ³Sequencing and Functional Genomics Unit, University of Zaragoza-IACS

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve uma técnica para geração de cybrid a partir de células cancerosas em crescimento em suspensão como uma ferramenta para estudar o papel das mitocôndrias no processo tumorigênico.

Resumo

Nos últimos anos, o número de estudos dedicados a determinar a ligação entre mitocôndrias e câncer aumentou significativamente. No entanto, mais esforços ainda são necessários para compreender completamente a ligação envolvendo alterações nas mitocôndrias e tumorigênese, bem como para identificar fenótipos mitocondriais associados ao tumor. Por exemplo, para avaliar a contribuição das mitocôndrias nos processos de tumorigênese e metástases, é essencial entender a influência das mitocôndrias de células tumorais em diferentes ambientes nucleares. Para isso, uma possível abordagem consiste em transferir mitocôndrias para um fundo nuclear diferente para obter as chamadas células cybrid. Nas técnicas tradicionais de cibridização, uma linhagem celular sem mtDNA (ρ⁰, célula doadora nuclear) é repovoada com mitocôndrias derivadas de células enucleadas ou plaquetas. No entanto, o processo de enucleação requer boa adesão celular à placa de cultura, característica que é parcial ou completamente perdida em muitos casos em células invasivas. Além disso, outra dificuldade encontrada nos métodos tradicionais é conseguir a remoção completa do mtDNA endógeno da linhagem celular receptora mitocondrial para obter fundos de DNA nuclear e mitocondrial puro, evitando a presença de duas espécies diferentes de mtDNA no cybrid gerado. Neste trabalho, apresentamos um protocolo de troca mitocondrial aplicado a células cancerosas em crescimento em suspensão, baseado na repopulação de células pré-tratadas com rodamina 6G com mitocôndrias isoladas. Esta metodologia permite superar as limitações das abordagens tradicionais e, assim, pode ser utilizada como uma ferramenta para ampliar a compreensão do papel mitocondrial na progressão e metástase do câncer.

Introdução

A reprogramação do metabolismo energético é uma marca do câncer¹ que foi observada pela primeira vez por Otto Warburg na década de 1930². Em condições aeróbicas, as células normais convertem a glicose em piruvato, que gera acetil-coA, alimentando a maquinaria mitocondrial e promovendo a respiração celular. No entanto, Warburg demonstrou que, mesmo sob condições normóxicas, a maioria das células cancerosas converte piruvato obtido do processo de glicólise em lactato, mudando seu caminho para obter energia. Esse ajuste metabólico é conhecido como "efeito Warburg" e permite que algumas células cancerosas suprim suas demanda....