JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Pesquisa do Câncer

Kanser Hücre Hatlarını Kullanarak İletimkokondriyal Cybrid Üretimi

Published: March 17, 2023
doi:
10.3791/65186
, , , , ,
1Department of Biochemistry,University of Zaragoza, 2Institute for Biocomputation and Physics of Complex Systems,University of Zaragoza, 3Sequencing and Functional Genomics Unit,University of Zaragoza-IACS

Summary

Bu protokol, süspansiyon büyüyen kanser hücrelerinden cybrid üretimi için bir tekniği, mitokondrinin tümörojenik süreçteki rolünü incelemek için bir araç olarak tanımlamaktadır.

Abstract

Son yıllarda, mitokondri ve kanser arasındaki bağlantıyı tespit etmeye adanmış çalışmaların sayısı önemli ölçüde artmıştır. Bununla birlikte, mitokondri ve tümörigenezdeki değişiklikleri içeren bağlantıyı tam olarak anlamak ve tümörle ilişkili mitokondriyal fenotipleri tanımlamak için daha fazla çabaya ihtiyaç vardır. Örneğin, mitokondrinin tümörigenez ve metastaz süreçlerine katkısını değerlendirmek için, mitokondrinin farklı nükleer ortamlardaki tümör hücrelerinden etkisini anlamak önemlidir. Bu amaçla, olası bir yaklaşım, sözde cybrid hücrelerini elde etmek için mitokondrinin farklı bir nükleer arka plana aktarılmasından oluşur. Geleneksel sibridizasyon tekniklerinde, mtDNA’dan (ρ0, nükleer donör hücre) yoksun bir hücre hattı, enüklee hücrelerden veya trombositlerden türetilen mitokondri ile yeniden doldurulur. Bununla birlikte, enükleasyon işlemi, invaziv hücrelerde birçok durumda kısmen veya tamamen kaybolan bir özellik olan kültür plakasına iyi hücre yapışmasını gerektirir. Ek olarak, geleneksel yöntemlerde bulunan bir diğer zorluk, saf nükleer ve mitokondriyal DNA arka planları elde etmek için endojen mtDNA’nın mitokondriyal alıcı hücre hattından tamamen çıkarılmasını sağlamak ve üretilen sibritte iki farklı mtDNA türünün varlığından kaçınmaktır. Bu çalışmada, izole mitokondri ile rodamin 6G ile önceden işlenmiş hücrelerin yeniden popülasyonuna dayanan süspansiyon büyüyen kanser hücrelerine uygulanan bir mitokondriyal değişim protokolü sunuyoruz. Bu metodoloji, geleneksel yaklaşımların sınırlamalarının üstesinden gelmemizi sağlar ve böylece kanser ilerlemesi ve metastazındaki mitokondriyal rolün anlaşılmasını genişletmek için bir araç olarak kullanılabilir.

Introduction

Enerji metabolizmasının yeniden programlanması, 1930’larda Otto Warburg tarafından ilk kez gözlemlenen kanser1’in ayırt edici bir özelliğidir2. Aerobik koşullar altında, normal hücreler glikozu piruvat’a dönüştürür, bu da asetil-coA üretir, mitokondriyal makineyi besler ve hücresel solunumu teşvik eder. Bununla birlikte, Warburg, normoksik koşullar altında bile, çoğu kanser hücresinin glikoliz işleminden elde edilen piruvatı laktata dönüştürdüğünü ve enerji elde etme yollarını değiştirdiğini göstermiştir. Bu metabolik ayarlama “Warburg etkisi” olarak bilinir ve bazı kanser hücrelerinin, ATP’yi aerobik süreçten daha az verimli bir şekilde üretmesine rağmen, hızlı büyüme ve bölünme için enerjik taleplerini karşılamalarını sağlar 3,4,5. Son yıllarda, çok sayıda çalışma, kanser progresyonunda metabolizmanın yeniden programlanmasının anlamını desteklemiştir. Bu nedenle, tümör enerjileri kansere karşı ilginç bir hedef olarak kabul edilir1. Enerjik metabolizmada ve temel öncüllerin tedarikinde merkezi bir merkez olarak, mitokondri, bugüne kadar sadece kısmen anladığımız bu hücre adaptasyonlarında kilit bir rol oynamaktadır.

Yukarıdakilere paralel olarak, mitokondriyal DNA (mtDNA) mutasyonları, bu metabolik yeniden programlamanın olası nedenlerinden biri olarak önerilmiştir; bu, bozulmuş bir elektron taşıma zinciri (ETC) performansına yol açabilir 6 ve bazı kanser hücrelerinin hayatta kalmak için neden glikolitik metabolizmalarını geliştirdiğini açıklayacaktır. Gerçekten de, mtDNA’nın kanser hücrelerinde mutasyonlar biriktirdiği, tümörlerin en az% 50’sinde mevcut olduğu bildirilmiştir7. Örneğin, Yuan ve ark. tarafından yürütülen yeni bir çalışma, böbrek, kolorektal ve tiroid kanserlerinde hipermutasyona uğramış ve kesilmiş mtDNA moleküllerinin varlığını bildirmiştir8. Dahası, birçok çalışma, bazı mtDNA mutasyonlarının daha agresif bir tümör fenotipi ve kanser hücrelerinin metastatik potansiyelindeki bir artışla ilişkili olduğunu göstermiştir 9,10,11,12,13,14,15,16.

Mitokondriyal genomun kanser progresyonundaki belirgin ilgisine rağmen, bu mutasyonların incelenmesi ve hastalığa katkıları, şu anda mevcut olan deneysel modellerdeki ve teknolojilerdeki sınırlamalar nedeniyle zor olmuştur17. Bu nedenle, mitokondri DNA’sının kanser hastalığının gelişimi ve ilerlemesindeki gerçek etkisini anlamak için yeni tekniklere ihtiyaç vardır. Bu çalışmada, geleneksel sibridizasyon yöntemlerinin ana zorluklarının üstesinden gelen, izole mitokondri ile rodamin 6G ile önceden işlenmiş hücrelerin yeniden popülasyonuna dayanan, süspansiyon büyüyen kanser hücrelerinden transmitokondriyal sibrid üretimi için bir protokol sunuyoruz18,19. Bu metodoloji, karşılık gelen ρ0 hücre hattının mevcudiyetine bakılmaksızın herhangi bir çekirdek donörünün kullanılmasına ve geleneksel teknikleri izleyerek enükleasyonu zor olan hücrelerden mitokondri transferine (yani, yapışkan olmayan hücre hatları) izin verir.

Protocol

NOT: Tüm kültür ortamları ve tampon bileşimleri Tablo 1’de belirtilmiştir. Sibrid üretiminden önce, hücre hatları arasındaki her iki genomda genetik farklılıkların varlığını doğrulamak için donör ve alıcı hücrelerden hem mitokondriyal hem de nükleer DNA profilleri yazılmalıdır. Bu çalışmada, ticari olarak temin edilebilen bir L929 hücre hattı ve laboratuvarımızda kendiliğinden oluşan türetilmiş hücre hattı L929dt kullanılmıştır (daha fazla bilgi için<sup clas…

Representative Results

Yukarıda sunulan protokolü izledikten sonra, korunmuş bir nükleer arka plana sahip, ancak yeni bir mitokondri genotipine sahip bir homoplazmik cybrid hücre hattı, Şekil 1 ve Şekil 2’deki şemalarda gösterildiği gibi elde edilmelidir. Sibritlerde bulunan mitokondriyal ve nükleer DNA’nın saflığı, Şekil 3’te gösterildiği gibi RFLP ve Şekil 4’te gösterildiği gibi nükleer DNA genotiplem…

Discussion

Otto Warburg, kanser hücrelerinin metabolizmalarını değiştirdiğini ve mitokondriyal solunumu azaltırken “aerobik glikoliz”i3,4 güçlendirdiğini bildirdiğinden, mitokondrinin kanser dönüşümü ve ilerlemesindeki rolüne olan ilgi katlanarak artmıştır. Son yıllarda, mtDNA’daki mutasyonlar ve mitokondriyal disfonksiyon, birçok kanser tipi25’in ayırt edici özellikleri olarak kabul edilmiştir. Bugüne kadar, çok sayıda ç…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu araştırma, RSA, JMB ve AA’ya PID2019-105128RB-I00 hibe numarası ve PFS ve RML’ye PGC2018-095795-B-I00 hibe numarası ile finanse edilmiş, her ikisi de MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 ve hibe numaraları B31_20R (RSA, JMA ve AA) ve E35_17R (PFS ve RML) tarafından finanse edilmiş ve Gobierno de Aragón tarafından finanse edilmiştir. RSA’nın çalışmaları, Asociación Española Contra el Cáncer (AECC) PRDAR21487SOLE’den bir hibe ile desteklendi. Yazarlar, Servicio General de Apoyo a la Investigación-SAI, Universidad de Zaragoza’nın kullanımını kabul etmek ister.

Materials

3500XL Genetic Analyzer  ThermoFisher Scientific 4406016
6-well plate Corning 08-772-1B
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich A3678
AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit ThermoFisher Scientific 4427368
Anode Buffer Container 3500 Series Applied Biosystems 4393927
Boric acid PanReac 131015
Bradford assay Biorad 5000002
Cathode Buffer Container 3500 Series Applied Biosystems 4408256
Cell culture flasks TPP 90076
DMEM high glucose Gibco 11965092
EDTA PanReac 131026
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich E8751
Geneticin Gibco 10131027
Homogenizer Teflon pestle Deltalab 196102
L929 cell line ATCC CCL-1
MiniProtean Tetra4 Gel System BioRad 1658004
MOPS Sigma-Aldrich M1254
PCR primers Sigma-Aldrich Custom products
Polyacrylamide Solution 30% PanReac A3626
Polyethylene glycol Sigma-Aldrich P7181
POP-7 Applied Biosystems 4393714
Pyruvate Sigma-Aldrich P5280
QIAmp DNA Mini Kit Qiagen 51306
Rhodamine-6G Sigma-Aldrich R4127
Serum Fetal Bovine Sigma-Aldrich F7524
SspI New England Biolabs R3132
Streptomycin/penicillin PAN biotech P06-07100
Sucrose Sigma-Aldrich S3089
TEMED Sigma-Aldrich T9281
Tris PanReac P14030b
Uridine Sigma-Aldrich U3750
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Hanahan, D. Hallmarks of cancer: new dimensions. Cancer Discovery. 12 (1), 31-46 (2022).
  2. Wind, F., Warburg, O. H. . The Metabolism of Tumors: Investigation from the Kaiser Wilhelm Institute for Biology. , (1930).
  3. Warburg, O. On respiratory impairment in cancer cells. Science. 124 (3215), 269-270 (1956).
  4. Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
  5. Weinhouse, S. On respiratory impairment in cancer cells. Science. 124 (3215), 267-269 (1956).
  6. Brandon, M., Baldi, P., Wallace, D. C. Mitochondrial mutations in cancer. Oncogene. 25 (34), 4647-4662 (2006).
  7. Ju, Y. S., et al. Origins and functional consequences of somatic mitochondrial DNA mutations in human cancer. eLife. 3, 02935 (2014).
  8. Yuan, Y., et al. Comprehensive molecular characterization of mitochondrial genomes in human cancers. Nature Genetics. 52 (3), 342-352 (2020).
  9. Arnold, R. S., et al. metastasis in prostate cancer: Recurring mitochondrial DNA mutation reveals selective pressure exerted by the bone microenvironment. Bone. 78, 81-86 (2015).
  10. Imanishi, H., et al. Mitochondrial DNA mutations regulate metastasis of human breast cancer cells. PLoS One. 6 (8), 23401 (2011).
  11. Lu, J., Sharma, L. K., Bai, Y. Implications of mitochondrial DNA mutations and mitochondrial dysfunction in tumorigenesis. Cell Research. 19 (7), 802-815 (2009).
  12. Luo, Y., Ma, J., Lu, W. The significance of mitochondrial dysfunction in cancer. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5598 (2020).
  13. Marco-Brualla, J., et al. Mutations in the ND2 subunit of mitochondrial complex I are sufficient to confer increased tumorigenic and metastatic potential to cancer cells. Cancers. 11 (7), 1027 (2019).
  14. Schopf, B., et al. OXPHOS remodeling in high-grade prostate cancer involves mtDNA mutations and increased succinate oxidation. Nature Communications. 11 (1), 1487 (2020).
  15. Yuan, Y., et al. Nonsense and missense mutation of mitochondrial ND6 gene promotes cell migration and invasion in human lung adenocarcinoma. BMC Cancer. 15, 346 (2015).
  16. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. 34;ROS-generating mitochondrial DNA mutations can regulate tumor cell metastasis"–a critical commentary. Free Radicals Biology and Medicine. 45 (9), 1217-1219 (2008).
  17. Welch, D. R., Foster, C., Rigoutsos, I. Roles of mitochondrial genetics in cancer metastasis. Trends in Cancer. 8 (12), 1002-1018 (2022).
  18. Cavaliere, A., Marchet, S., Di Meo, I., Tiranti, V. An in vitro approach to study mitochondrial dysfunction: A cybrid model. Journal of Visualized Experiments. (181), e63452 (2022).
  19. King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
  20. Bacman, S. R., Moraes, C. T. Transmitochondrial technology in animal cells. Methods in Cell Biology. 80, 503-524 (2007).
  21. Moraes, C. T., Dey, R., Barrientos, A. Transmitochondrial technology in animal cells. Methods in Cell Biology. 65, 397-412 (2001).
  22. Acin-Perez, R., et al. Respiratory complex III is required to maintain complex I in mammalian mitochondria. Molecular Cell. 13 (6), 805-815 (2004).
  23. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  24. Bayona-Bafaluy, M. P., et al. Revisiting the mouse mitochondrial DNA sequence. Nucleic Acids Research. 31 (18), 5349-5355 (2003).
  25. Srinivasan, S., Guha, M., Kashina, A., Avadhani, N. G. Mitochondrial dysfunction and mitochondrial dynamics-The cancer connection. Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1858 (8), 602-614 (2017).
  26. Bartoletti-Stella, A., et al. Mitochondrial DNA mutations in oncocytic adnexal lacrimal glands of the conjunctiva. Archives of Ophthalmology. 129 (5), 664-666 (2011).
  27. Chinnery, P. F., Samuels, D. C., Elson, J., Turnbull, D. M. Accumulation of mitochondrial DNA mutations in ageing, cancer, and mitochondrial disease: is there a common mechanism. The Lancet. 360 (9342), 1323-1325 (2002).
  28. Copeland, W. C., Wachsman, J. T., Johnson, F. M., Penta, J. S. Mitochondrial DNA alterations in cancer. Cancer Investigation. 20 (4), 557-569 (2002).
  29. Gasparre, G., et al. Clonal expansion of mutated mitochondrial DNA is associated with tumor formation and complex I deficiency in the benign renal oncocytoma. Human Molecular Genetics. 17 (7), 986-995 (2008).
  30. Kopinski, P. K., Singh, L. N., Zhang, S., Lott, M. T., Wallace, D. C. Mitochondrial DNA variation and cancer. Nature Review Cancer. 21 (7), 431-445 (2021).
  31. Pereira, L., Soares, P., Maximo, V., Samuels, D. C. Somatic mitochondrial DNA mutations in cancer escape purifying selection and high pathogenicity mutations lead to the oncocytic phenotype: pathogenicity analysis of reported somatic mtDNA mutations in tumors. BMC Cancer. 12, 53 (2012).
  32. Wallace, D. C. Mitochondria and cancer. Nature Reviews. Cancer. 12 (10), 685-698 (2012).
  33. Hopkins, J. F., et al. Mitochondrial mutations drive prostate cancer aggression. Nature Communications. 8 (1), 656 (2017).
  34. Weerts, M. J. A., Smid, M., Foekens, J. A., Sleijfer, S., Martens, J. W. M. Mitochondrial RNA expression and single nucleotide variants in association with clinical parameters in primary breast cancers. Cancers. 10 (12), 500 (2018).
  35. Jimenez-Morales, S., Perez-Amado, C. J., Langley, E., Hidalgo-Miranda, A. Overview of mitochondrial germline variants and mutations in human disease: Focus on breast cancer (Review). International Journal of Oncology. 53 (3), 923-936 (2018).
  36. Hardie, D. G. AMP-activated/SNF1 protein kinases: conserved guardians of cellular energy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 774-785 (2007).
  37. Perrone, A. M., et al. Potential for mitochondrial DNA sequencing in the differential diagnosis of gynaecological malignancies. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2048 (2018).
  38. Musicco, C., et al. Mitochondrial dysfunctions in type I endometrial carcinoma: Exploring their role in oncogenesis and tumor progression. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2076 (2018).
  39. Li, N., et al. Dissecting the expression landscape of mitochondrial genes in lung squamous cell carcinoma and lung adenocarcinoma. Oncology Letters. 16 (3), 3992-4000 (2018).
  40. Kim, H. R., et al. Spectrum of mitochondrial genome instability and implication of mitochondrial haplogroups in Korean patients with acute myeloid leukemia. Blood Research. 53 (3), 240-249 (2018).
  41. Tyagi, A., et al. Pattern of mitochondrial D-loop variations and their relation with mitochondrial encoded genes in pediatric acute myeloid leukemia. Mutation Research. 810, 13-18 (2018).
  42. Vidone, M., et al. A comprehensive characterization of mitochondrial DNA mutations in glioblastoma multiforme. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 63, 46-54 (2015).
  43. Chatterjee, A., Mambo, E., Sidransky, D. Mitochondrial DNA mutations in human cancer. Oncogene. 25 (34), 4663-4674 (2006).
  44. Arnold, R. S., et al. An inherited heteroplasmic mutation in mitochondrial gene COI in a patient with prostate cancer alters reactive oxygen, reactive nitrogen and proliferation. BioMed Research International. 2013, 239257 (2013).
  45. Petros, J. A., et al. mtDNA mutations increase tumorigenicity in prostate cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (3), 719-724 (2005).
  46. Wallace, D. C., Fan, W., Procaccio, V. Mitochondrial energetics and therapeutics. Annual Review of Pathology. 5, 297-348 (2010).
  47. Reznik, E., et al. Mitochondrial DNA copy number variation across human cancers. eLife. 5, 10769 (2016).
  48. Soler-Agesta, R., et al. PT-112 induces mitochondrial stress and immunogenic cell death, targeting tumor cells with mitochondrial deficiencies. Cancers. 14 (16), 3851 (2022).
  49. Trounce, I., Wallace, D. C. Production of transmitochondrial mouse cell lines by cybrid rescue of rhodamine-6G pre-treated L-cells. Somatic Cell and Molecular Genetics. 22 (1), 81-85 (1996).
  50. Pastushenko, I., Blanpain, C. EMT transition states during tumor progression and metastasis. Trends in Cell Biology. 29 (3), 212-226 (2019).
  51. Pastushenko, I., et al. Identification of the tumour transition states occurring during EMT. Nature. 556 (7702), 463-468 (2018).
  52. Thiery, J. P., Sleeman, J. P. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 131-142 (2006).

Tags

Transmitochondrial CybridCancer Cell LinesMitochondrial GenotypesCancer ProgressionMetastasisMitochondrial DNA MutationsAerobic GlycolysisTumorigenesisMitochondrial PhenotypesCybrid Cells
check_url/pt/65186?article_type=t&slug=transmitochondrial-cybrid-generation-using-cancer-cell-lines

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Soler-Agesta, R., Marco-Brualla, J., Fernández-Silva, P., Mozas, P., Anel, A., Moreno Loshuertos, R. Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines. J. Vis. Exp. (193), e65186, doi:10.3791/65186 (2023).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image