De MouseWalker gebruiken om locomotorische disfunctie te kwantificeren in een muismodel van dwarslaesie
Summary
Een experimentele pijplijn om het bewegingspatroon van vrij lopende muizen kwantitatief te beschrijven met behulp van de MouseWalker (MW) toolbox wordt geleverd, variërend van initiële video-opnames en tracking tot post-kwantificeringsanalyse. Een dwarslaesiemodel bij muizen wordt gebruikt om het nut van het MW-systeem aan te tonen.
Abstract
De uitvoering van complexe en sterk gecoördineerde motorische programma’s, zoals lopen en hardlopen, is afhankelijk van de ritmische activering van spinale en supra-spinale circuits. Na een thoracale dwarslaesie is de communicatie met stroomopwaartse circuits verstoord. Dit leidt op zijn beurt tot een verlies van coördinatie, met een beperkt herstelpotentieel. Om de mate van herstel na toediening van geneesmiddelen of therapieën beter te evalueren, is er dus behoefte aan nieuwe, meer gedetailleerde en nauwkeurige hulpmiddelen om gang, ledemaatcoördinatie en andere fijne aspecten van locomotorisch gedrag in diermodellen van ruggenmergletsel te kwantificeren. In de loop der jaren zijn verschillende testen ontwikkeld om het vrijloopgedrag bij knaagdieren kwantitatief te beoordelen; Ze missen echter meestal directe metingen met betrekking tot staploopstrategieën, voetafdrukpatronen en coördinatie. Om deze tekortkomingen aan te pakken, wordt een bijgewerkte versie van de MouseWalker geleverd, die een gefrustreerde totale interne reflectie (fTIR) loopbrug combineert met tracking- en kwantificeringssoftware. Dit open-source systeem is aangepast om verschillende grafische outputs en kinematische parameters te extraheren, en een set post-kwantificeringstools kan zijn om de verstrekte outputgegevens te analyseren. Dit manuscript laat ook zien hoe deze methode, in combinatie met reeds gevestigde gedragstests, motorische tekorten na een dwarslaesie kwantitatief beschrijft.
Introduction
De effectieve coördinatie van vier ledematen is niet uniek voor viervoetige dieren. De coördinatie van de voorpoot en de achterpoot bij de mens blijft belangrijk om verschillende taken uit te voeren, zoals zwemmen en veranderingen in snelheid tijdens het lopen1. Verschillende ledemaatkinematisch 2 en motorisch programma 1,3,4, evenals proprioceptieve feedbackcircuits5, worden bewaard tussen mensen en andere zoogdieren en moeten worden overwogen bij het analyseren van therapeutische opties voor motorische aandoeningen, zoals dwarslaesie (SCI)6,7,8.
Om te kunnen lopen, moeten verschillende spinale verbindingen van de voorpoten en achterpoten goed worden bedraad en ritmisch worden geactiveerd, wat input van de hersenen en feedback van het somatosensorische systeem vereist 2,9,10. Deze verbindingen culmineren in de centrale patroongeneratoren (CLB’s), die zich op cervicaal en lumbaal niveau bevinden voor de voorpoten en achterpoten, respectievelijk 1,9,10. Vaak, na dwarslaesie, beperken de verstoring van neuronale connectiviteit en de vorming van een remmend gliaal litteken12 het herstel van de locomotorische functie, met uitkomsten variërend van totale verlamming tot beperkte functie van een groep ledematen, afhankelijk van de ernst van het letsel. Hulpmiddelen om de locomotorische functie na dwarslaesie nauwkeurig te kwantificeren zijn van cruciaal belang voor het monitoren van herstel en het evalueren van de effecten van behandelingen of andere klinische interventies6.
De standaard metrische test voor muiscontusiemodellen van SCI is de Basso-muisschaal (BMS)13,14, een niet-parametrische score die rekening houdt met rompstabiliteit, staartpositie, plantaire stepping en voorpoot-achterledemaatcoördinatie in een open veldarena. Hoewel het BMS in de meeste gevallen uiterst betrouwbaar is, vereist het ten minste twee ervaren beoordelaars om alle hoeken van dierbewegingen te observeren om rekening te houden met natuurlijke variabiliteit en vertekening te verminderen.
Andere testen zijn ook ontwikkeld om motorische prestaties na SCI kwantitatief te beoordelen. Deze omvatten de rotarod-test, die de tijd meet die wordt besteed aan een roterende cilinder15; de horizontale ladder, die het aantal gemiste leuningen en positieve laddergrijpers meet16,17; en de balklooptest, die de tijd meet die een dier nodig heeft en het aantal fouten dat het maakt bij het overschrijden van een smalle balk18. Ondanks een combinatie van motorische tekorten, produceert geen van deze tests directe locomotorische informatie over de coördinatie van de voorpoot-achterpoot.
Om loopgedrag specifiek en grondiger te analyseren, zijn andere testen ontwikkeld om stapcycli en loopstrategieën te reconstrueren. Een voorbeeld is de voetafdruktest, waarbij de geïnkte poten van een dier een patroon tekenen over een vel wit papier19. Hoewel eenvoudig in zijn uitvoering, is het extraheren van kinematische parameters zoals paslengte omslachtig en onnauwkeurig. Bovendien beperkt het ontbreken van dynamische parameters, zoals de duur van de stapcyclus of beengetimede coördinatie, de toepassingen ervan; Inderdaad, deze dynamische parameters kunnen alleen worden verkregen door frame-voor-frame video’s van knaagdieren die door een transparant oppervlak lopen te analyseren. Voor SCI-studies hebben onderzoekers het loopgedrag geanalyseerd vanuit een zijaanzicht met behulp van een loopband, inclusief het reconstrueren van de stapcyclus en het meten van de hoekvariaties van elk beengewricht 4,20,21. Hoewel deze aanpak uiterst informatief kan zijn6, blijft het gericht op een specifieke set ledematen en mist het extra loopfuncties, zoals coördinatie.
Om deze hiaten op te vullen, ontwikkelden Hamers en collega’s een kwantitatieve test op basis van een optische aanraaksensor met behulp van gefrustreerde totale interne reflectie (fTIR)22. Bij deze methode plant licht zich via interne reflectie door glas, wordt het verstrooid bij het drukken van de poten en wordt het uiteindelijk vastgelegd door een hogesnelheidscamera. Meer recent werd een open-source versie van deze methode, genaamd MouseWalker, beschikbaar gesteld, en deze aanpak combineert een fTIR-loopbrug met een tracking- en kwantificeringssoftwarepakket23. Met behulp van deze methode kan de gebruiker een grote reeks kwantitatieve parameters extraheren, waaronder stap-, ruimte- en looppatronen, voetafdrukpositionering en coördinatie van de voorpoot-achterpoot, evenals visuele outputs, zoals voetafdrukpatronen (die de geïnkte poottest6 nabootsen) of houdingsfasen ten opzichte van de lichaamsas. Belangrijk is dat vanwege het open-source karakter nieuwe parameters kunnen worden geëxtraheerd door het MATLAB-scriptpakket bij te werken.
Hier wordt de eerder gepubliceerde assemblage van het MouseWalker23-systeem bijgewerkt. Er wordt een beschrijving gegeven van hoe u het kunt instellen, met alle stappen die nodig zijn om de beste videokwaliteit, trackingcondities en parameteracquisitie te bereiken. Aanvullende post-kwantificeringstools worden ook gedeeld om de analyse van de MouseWalker (MW) outputdataset te verbeteren. Ten slotte wordt het nut van deze tool aangetoond door het verkrijgen van kwantificeerbare waarden voor algemene locomotorische prestaties, met name stapcycli en voorpoot-achterpootcoördinatie, in een context van dwarslaesie (SCI).
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier wordt het potentieel van de MouseWalker-methode aangetoond door het locomotorisch gedrag na dwarslaesie te analyseren. Het biedt nieuwe inzichten in specifieke veranderingen in stap-, voetafdruk- en looppatronen die anders zouden worden gemist door andere standaardtests. Naast het leveren van een bijgewerkte versie van het MW-pakket, worden ook data-analysetools beschreven met behulp van de meegeleverde Python-scripts (zie stap 5).
Omdat de MW een grote dataset en een verzameling kinemati…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Laura Tucker en Natasa Loncarevic voor hun commentaar op het manuscript en de steun van de knaagdierfaciliteit van het Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes. De auteurs willen de financiële steun van Prémios Santa Casa Neurociências – Prijs Melo e Castro voor onderzoek naar dwarslaesie (MC-36/2020) aan L.S. en C.S.M. erkennen. Dit werk werd ondersteund door Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) (PTDC/BIA-COM/0151/2020), iNOVA4Health (UIDB/04462/2020 en UIDP/04462/2020), en LS4FUTURE (LA/P/0087/2020) aan C.S.M. L.S. werd ondersteund door een CEEC Individual Principal Investigator contract (2021.02253.CEECIND). A.F.I. werd ondersteund door een doctoraatsbeurs van FCT (2020.08168.BD). A.M.M. werd ondersteund door een doctoraatsbeurs van FCT (PD/BD/128445/2017). I.M. werd ondersteund door een postdoctoraal fellowship van FCT (SFRH/BPD/118051/2016). D.N.S. werd ondersteund door een doctoraatsbeurs van FCT (SFRH/BD/138636/2018).
Materials
| 45º Mirror | |||
| 2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 16 cm height, 1 on each side | Misumi | ||
| 2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 23 cm, @ 45° , 1 on each side | Misumi | ||
| 1 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 83 cm long | Misumi | ||
| 87 x 23 cm mirror | General glass supplier | ||
| black cardboard filler | General stationery supplier | We used 2, one with 69 x 6 cm and another with 69 x 3cm to limit the reflection on the mirror | |
| Background backlight | |||
| 109 x 23 cm plexiglass (0.9525 cm thick) | General hardware supplier | ||
| 2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm), 20 cm long, 1 on each side | Misumi | ||
| multicolor LED strip | General hardware supplier | ||
| white opaque paper to cover the plexyglass | General stationery supplier | ||
| fTIR Support base and posts | |||
| 2 aluminum extrusion (4 x 4 cm), 100 cm height | Misumi | ||
| 60 x 30 cm metric breadboard | Edmund Optics | #54-641 | |
| M6 12 mm screws | Edmund Optics | ||
| M6 hex nuts and wahers | Edmund Optics | ||
| fTIR Walkway | |||
| 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | General hardware supplier | 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | |
| 109 cm long Base-U-channel aluminum with 1.6 cm height x 1.9 cm depth thick folds (to hold the plexyglass) | General hardware supplier | ||
| 2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm) 20 cm length, 1 on each side | Misumi | ||
| black cardboard filler | General stationery supplier | we used 2 fillers on each side to cover the limits of the plexyglass, avoiding bright edges | |
| 12 mm screws | Edmund Optics | M6 | |
| High speed camera (on a tripod) | |||
| Blackfly S USB3 | Blackfly | USB3 | This is a reccomendation. The requirement is to record at least 100 frames per second |
| Infinite Horizon Impactor | |||
| Infinite Horizon Impactor | Precision Systems and Instrumentation, LLC. | ||
| Lens | |||
| Nikkon AF Zoom-Nikkor 24-85mm | Nikkon | 2.8-4D IF | This lens is reccomended, however other lens can be used. Make sure it contains a large aperture (i.e., smaller F-stop values), to capture fTIR signals |
| Software | |||
| MATLAB R2022b | MathWorks | ||
| Python 3.9.13 | Python Software Foundation | ||
| Anaconda Navigator 2.1.4 | Anaconda, Inc. | ||
| Spyder 5.1.5 | Spyder Project Contributors | ||
| Walkway wall | |||
| 2 large rectagular acrilics with 100 x 15 cm | Any bricolage convenience store | ||
| 2 Trapezian acrilic laterals with 6-10 length x 15 cm height | Any bricolage convenience store | ||
| GitHub Materials | |||
| Folder name | URL | ||
| Boxplots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Boxplots | Script to create Boxplots | |
| Docs | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Docs | Additional documents | |
| Heatmap | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Heatmaps | Script to create heatmap | |
| Matlat script | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20Script | MouseWalker matlab script | |
| PCA | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plots | Script to perform Principal Component Analysis | |
| Raw data Plots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20Plots | Script to create Raw data plots | |
| Residual Analysis | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_Analysis | Code to compute residuals from Raw data |
Referências
- Frigon, A. The neural control of interlimb coordination during mammalian locomotion. Journal of Neurophysiology. 117 (6), 2224-2241 (2017).
- Grillner, S. Biological pattern generation: The cellular and computational logic of networks in motion. Neuron. 52 (5), 751-766 (2006).
- Dominici, N., et al. locomotor primitives in newborn babies and their development. Science. 334 (6058), 997-999 (2011).
- Courtine, G., et al. Kinematic and EMG determinants in quadrupedal locomotion of a non-human primate (Rhesus). Journal of Neurophysiology. 93 (6), 3127-3145 (2005).
- Clarac, F., Cattaert, D., le Ray, D. Central control components of a ‘simple’ stretch reflex. Trends Neuroscience. 23 (5), 199-208 (2000).
- Squair, J. W., Gautier, M., Sofroniew, M. V., Courtine, G., Anderson, M. A. Engineering spinal cord repair. Current Opinion in Biotechnology. 72, 48-53 (2021).
- Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
- Grillner, S. The spinal locomotor CPG: A target after spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 97-108 (2002).
- Boulain, M., et al. Synergistic interaction between sensory inputs and propriospinal signalling underlying quadrupedal locomotion. Journal of Physiology. 599 (19), 4477-4496 (2021).
- Skarlatou, S., et al. Afadin signaling at the spinal neuroepithelium regulates central canal formation and gait selection. Cell Reports. 31 (10), 107741 (2020).
- Viala, D., Vidal, C. Evidence for distinct spinal locomotion generators supplying respectively fore-and hindlimbs in the rabbit. Brain Research. 155 (1), 182-186 (1978).
- Silver, J., Miller, J. H. Regeneration beyond the glial scar. Nature Reviews Neuroscience. 5 (2), 146-156 (2004).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
- Basso, D. M., et al. Basso mouse scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. Journal of Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantitative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an accelerating rotarod. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 20 (4), 302-304 (1968).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. The ladder rung walking task: A scoring system and its practical application. Journal of Visualized Experiments. (28), e1204 (2009).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: A new task to evaluate fore-and hindlimb stepping, placing, and coordination. Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
- Wallace, J. E., Krauter, E. E., Campbell, B. A. Motor and reflexive behavior in the aging rat. Journal of Gerontology. 35 (3), 364-370 (1980).
- Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington’s disease mutation. The Journal of Neuroscience. 19 (8), 3248-3257 (1999).
- Leblond, H., L’espérance, M., Orsal, D., Rossignol, S. Behavioral/systems/cognitive treadmill locomotion in the intact and spinal mouse. The Journal of Neuroscience. 23 (36), 11411-11419 (2003).
- Courtine, G., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nature Medicine. 14 (1), 69-74 (2008).
- Hamers, F. P. T., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. J. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
- Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13 (1), 50 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Stauch, K. L., et al. Applying the ratwalker system for gait analysis in a genetic rat model of Parkinson’s disease. Journal of Visualized Experiments. (167), e62002 (2021).
- Mendes, C. S., Rajendren, S. V., Bartos, I., Márka, S., Mann, R. S. Kinematic responses to changes in walking orientation and gravitational load in Drosophila melanogaster. PLoS One. 9 (10), e109204 (2014).
- Cabrita, A., et al. Motor dysfunction in Drosophila melanogaster as a biomarker for developmental neurotoxicity. iScience. 25 (7), 104541 (2022).
- Bishop, C. M. . Pattern Recognition and Machine Learning. , (2006).
- vander Maaten, L., Postma, E., vanden Herik, J. . Dimensionality reduction: A comparative review. , (2009).
- Courtine, G., et al. Performance of locomotion and foot grasping following a unilateral thoracic corticospinal tract lesion in monkeys (Macaca mulatta). Brain. 128 (10), 2338-2358 (2005).
- Drew, T., Jiang, W., Kably, B., Lavoie, S. Role of the motor cortex in the control of visually triggered gait modifications. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 74 (4), 426-442 (1996).
- Cheng, H., et al. Gait analysis of adult paraplegic rats after spinal cord repair. Experimental Neurology. 148 (2), 544-557 (1997).
- Thibaudier, Y., et al. Interlimb coordination during tied-belt and transverse split-belt locomotion before and after an incomplete spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 34 (9), 1751-1765 (2017).
- Bellardita, C., Kiehn, O. Phenotypic characterization of speed-associated gait changes in mice reveals modular organization of locomotor networks. Current Biology. 25 (11), 1426-1436 (2015).
- Machado, A. S., Marques, H. G., Duarte, D. F., Darmohray, D. M., Carey, M. R. Shared and specific signatures of locomotor ataxia in mutant mice. eLife. 9, 55356 (2020).
- Takeoka, A., Vollenweider, I., Courtine, G., Arber, S. Muscle spindle feedback directs locomotor recovery and circuit reorganization after spinal cord injury. Cell. 159 (7), 1626-1639 (2014).
