Brug af MouseWalker til at kvantificere lokomotorisk dysfunktion i en musemodel af rygmarvsskade
Summary
En eksperimentel pipeline til kvantitativt at beskrive det bevægelige mønster af frit gående mus ved hjælp af MouseWalker (MW) værktøjskassen leveres, lige fra indledende videooptagelser og sporing til efterkvantificeringsanalyse. En rygmarvskontusionsskademodel i mus anvendes til at demonstrere nytten af MW-systemet.
Abstract
Udførelsen af komplekse og stærkt koordinerede motorprogrammer, såsom gang og løb, er afhængig af den rytmiske aktivering af spinal og supra-spinal kredsløb. Efter en thorax rygmarvsskade er kommunikationen med opstrøms kredsløb nedsat. Dette fører igen til tab af koordination med begrænset genopretningspotentiale. For bedre at evaluere graden af genopretning efter administration af lægemidler eller terapier er der derfor behov for nye, mere detaljerede og nøjagtige værktøjer til at kvantificere gang, lemmerkoordination og andre fine aspekter af lokomotorisk adfærd i dyremodeller af rygmarvsskade. Flere analyser er blevet udviklet gennem årene for kvantitativt at vurdere frigående adfærd hos gnavere; De mangler dog normalt direkte målinger relateret til tringangstrategier, fodaftryksmønstre og koordinering. For at afhjælpe disse mangler leveres en opdateret version af MouseWalker, som kombinerer en frustreret total intern refleksion (fTIR) gangbro med sporings- og kvantificeringssoftware. Dette open source-system er blevet tilpasset til at udtrække flere grafiske output og kinematiske parametre, og et sæt efterkvantificeringsværktøjer kan være at analysere de leverede outputdata. Dette manuskript viser også, hvordan denne metode, allieret med allerede etablerede adfærdstests, kvantitativt beskriver lokomotoriske underskud efter rygmarvsskade.
Introduction
Den effektive koordinering af fire lemmer er ikke unik for firbenede dyr. Forben-bagben-koordination hos mennesker er fortsat vigtig for at udføre flere opgaver, såsom svømning og ændringer i hastighed, mens de går1. Forskellige lemmerkinematiske2 og motoriske program 1,3,4 samt proprioceptive feedbackkredsløb5 bevares mellem mennesker og andre pattedyr og bør overvejes ved analyse af terapeutiske muligheder for motoriske lidelser, såsom rygmarvsskade (SCI)6,7,8.
For at kunne gå skal flere rygforbindelser fra forbenene og bagbenene være korrekt forbundet og rytmisk aktiveret, hvilket kræver input fra hjernen og feedback fra det somatosensoriske system 2,9,10. Disse forbindelser kulminerer i de centrale mønstergeneratorer (CPG’er), som er placeret på cervikal- og lændeniveau for henholdsvisforben og bagben 1,9,10. Ofte, efter SCI, begrænser forstyrrelsen af neuronal forbindelse og dannelsen af et hæmmende glialar12 genopretningen af lokomotorisk funktion, med resultater, der varierer fra total lammelse til begrænset funktion af en gruppe lemmer afhængigt af skadens sværhedsgrad. Værktøjer til præcis kvantificering af bevægelsesfunktionen efter SCI er afgørende for overvågning af helbredelse og evaluering af virkningerne af behandlinger eller andre kliniske indgreb6.
Standardmetrisk analyse for musekontusionsmodeller af SCI er Basso-museskalaen (BMS)13,14, en ikke-parametrisk score, der tager højde for trunkstabilitet, haleposition, plantartrin og koordination mellem forben og bagben i en arena med åbent felt. Selvom BMS er ekstremt pålidelig i de fleste tilfælde, kræver det mindst to erfarne raters at observere alle vinkler af dyrebevægelser for at tage højde for naturlig variabilitet og reducere bias.
Andre assays er også blevet udviklet til kvantitativ vurdering af motorens ydeevne efter SCI. Disse omfatter rotarod-testen, som måler tid brugt på en roterende cylinder15; den vandrette stige, der måler antallet af ubesvarede rækværk og positive stigegreb16,17; og strålegangstesten, som måler den tid, et dyr tager, og antallet af fejl, det laver, når det krydser en smal stråle18. På trods af at de afspejler en kombination af motoriske underskud, producerer ingen af disse tests direkte lokomotorisk information om koordination mellem forben og bagben.
For specifikt og mere grundigt at analysere gangadfærd er der udviklet andre assays til at rekonstruere trincyklusser og gangstrategier. Et eksempel er fodaftrykstesten, hvor et dyrs sværtede poter tegner et mønster over et ark hvidt papir19. Selvom det er enkelt i udførelsen, er det besværligt og unøjagtigt at udtrække kinematiske parametre som skridtlængde. Desuden begrænser manglen på dynamiske parametre, såsom varigheden af trincyklussen eller lovgivningsmæssig koordinering, dens anvendelser; Faktisk kan disse dynamiske parametre kun erhverves ved at analysere ramme-for-ramme-videoer af gnavere, der går gennem en gennemsigtig overflade. Til SCI-undersøgelser har forskere analyseret gangadfærd fra et lateralt billede ved hjælp af et løbebånd, herunder rekonstruktion af trincyklussen og måling af vinkelvariationerne i hvert benled 4,20,21. Selvom denne tilgang kan være yderst informativ6, forbliver den fokuseret på et specifikt sæt lemmer og mangler yderligere gangfunktioner, såsom koordinering.
For at udfylde disse huller udviklede Hamers og kolleger en kvantitativ test baseret på en optisk berøringssensor ved hjælp af frustreret total intern refleksion (fTIR)22. I denne metode formerer lys sig gennem glas via intern refleksion, bliver spredt ved potetryk og fanges til sidst af et højhastighedskamera. For nylig blev en open source-version af denne metode, kaldet MouseWalker, gjort tilgængelig, og denne tilgang kombinerer en fTIR-gangbro med en sporings- og kvantificeringssoftwarepakke23. Ved hjælp af denne metode kan brugeren udtrække et stort sæt kvantitative parametre, herunder trin-, rum- og gangmønstre, fodaftrykspositionering og koordination mellem forben og bagben samt visuelle output, såsom fodaftryksmønstre (efterligner den sværtede poteanalyse6) eller holdningsfaser i forhold til kropsaksen. Det er vigtigt, at nye parametre på grund af dets open source-karakter kan ekstraheres ved at opdatere MATLAB-scriptpakken.
Her opdateres den tidligere offentliggjorte samling af MouseWalker23-systemet . Der gives en beskrivelse af, hvordan du konfigurerer det, med alle de trin, der kræves for at opnå den bedste videokvalitet, sporingsbetingelser og parameteroptagelse. Yderligere efterkvantificeringsværktøjer deles også for at forbedre analysen af MouseWalker (MW) outputdatasættet. Endelig demonstreres nytten af dette værktøj ved at opnå kvantificerbare værdier for generel lokomotorisk ydeevne, specifikt trincyklusser og koordination mellem forben og bagben, i en rygmarvsskade (SCI) sammenhæng.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her demonstreres potentialet i MouseWalker-metoden ved at analysere bevægelsesadfærd efter SCI. Det giver ny indsigt i specifikke ændringer i trin-, fodaftryks- og gangmønstre, som ellers ville blive overset af andre standardtests. Ud over at levere en opdateret version af MW-pakken beskrives dataanalyseværktøjer også ved hjælp af de medfølgende Python-scripts (se trin 5).
Da MW genererer et stort datasæt og en samling kinematiske parametre, der afspejler en meget dimensionel lokomot…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Laura Tucker og Natasa Loncarevic for deres kommentarer til manuskriptet og støtten fra gnaveranlægget ved Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes. Forfatterne ønsker at anerkende økonomisk støtte fra Prémios Santa Casa Neurociências – Prize Melo e Castro for forskning i rygmarvsskade (MC-36/2020) til L.S. og CSM. Dette arbejde blev støttet af Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) (PTDC/BIA-COM/0151/2020), iNOVA4Health (UIDB/04462/2020 og UIDP/04462/2020) og LS4FUTURE (LA/P/0087/2020) til C.S.M. L.S. blev støttet af en kontrakt med CEEC Individual Principal Investigator (2021.02253.CEECIND). A.F.I. blev støttet af et ph.d.-stipendium fra FCT (2020.08168.BD). AMM blev støttet af et ph.d.-stipendium fra FCT (PD / BD / 128445 / 2017). I.M. blev støttet af et postdoktoralt stipendium fra FCT (SFRH / BPD / 118051 / 2016). D.N.S. blev støttet af et ph.d.-stipendium fra FCT (SFRH / BD / 138636 / 2018).
Materials
| 45º Mirror | |||
| 2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 16 cm height, 1 on each side | Misumi | ||
| 2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 23 cm, @ 45° , 1 on each side | Misumi | ||
| 1 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 83 cm long | Misumi | ||
| 87 x 23 cm mirror | General glass supplier | ||
| black cardboard filler | General stationery supplier | We used 2, one with 69 x 6 cm and another with 69 x 3cm to limit the reflection on the mirror | |
| Background backlight | |||
| 109 x 23 cm plexiglass (0.9525 cm thick) | General hardware supplier | ||
| 2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm), 20 cm long, 1 on each side | Misumi | ||
| multicolor LED strip | General hardware supplier | ||
| white opaque paper to cover the plexyglass | General stationery supplier | ||
| fTIR Support base and posts | |||
| 2 aluminum extrusion (4 x 4 cm), 100 cm height | Misumi | ||
| 60 x 30 cm metric breadboard | Edmund Optics | #54-641 | |
| M6 12 mm screws | Edmund Optics | ||
| M6 hex nuts and wahers | Edmund Optics | ||
| fTIR Walkway | |||
| 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | General hardware supplier | 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | |
| 109 cm long Base-U-channel aluminum with 1.6 cm height x 1.9 cm depth thick folds (to hold the plexyglass) | General hardware supplier | ||
| 2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm) 20 cm length, 1 on each side | Misumi | ||
| black cardboard filler | General stationery supplier | we used 2 fillers on each side to cover the limits of the plexyglass, avoiding bright edges | |
| 12 mm screws | Edmund Optics | M6 | |
| High speed camera (on a tripod) | |||
| Blackfly S USB3 | Blackfly | USB3 | This is a reccomendation. The requirement is to record at least 100 frames per second |
| Infinite Horizon Impactor | |||
| Infinite Horizon Impactor | Precision Systems and Instrumentation, LLC. | ||
| Lens | |||
| Nikkon AF Zoom-Nikkor 24-85mm | Nikkon | 2.8-4D IF | This lens is reccomended, however other lens can be used. Make sure it contains a large aperture (i.e., smaller F-stop values), to capture fTIR signals |
| Software | |||
| MATLAB R2022b | MathWorks | ||
| Python 3.9.13 | Python Software Foundation | ||
| Anaconda Navigator 2.1.4 | Anaconda, Inc. | ||
| Spyder 5.1.5 | Spyder Project Contributors | ||
| Walkway wall | |||
| 2 large rectagular acrilics with 100 x 15 cm | Any bricolage convenience store | ||
| 2 Trapezian acrilic laterals with 6-10 length x 15 cm height | Any bricolage convenience store | ||
| GitHub Materials | |||
| Folder name | URL | ||
| Boxplots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Boxplots | Script to create Boxplots | |
| Docs | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Docs | Additional documents | |
| Heatmap | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Heatmaps | Script to create heatmap | |
| Matlat script | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20Script | MouseWalker matlab script | |
| PCA | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plots | Script to perform Principal Component Analysis | |
| Raw data Plots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20Plots | Script to create Raw data plots | |
| Residual Analysis | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_Analysis | Code to compute residuals from Raw data |
Referências
- Frigon, A. The neural control of interlimb coordination during mammalian locomotion. Journal of Neurophysiology. 117 (6), 2224-2241 (2017).
- Grillner, S. Biological pattern generation: The cellular and computational logic of networks in motion. Neuron. 52 (5), 751-766 (2006).
- Dominici, N., et al. locomotor primitives in newborn babies and their development. Science. 334 (6058), 997-999 (2011).
- Courtine, G., et al. Kinematic and EMG determinants in quadrupedal locomotion of a non-human primate (Rhesus). Journal of Neurophysiology. 93 (6), 3127-3145 (2005).
- Clarac, F., Cattaert, D., le Ray, D. Central control components of a ‘simple’ stretch reflex. Trends Neuroscience. 23 (5), 199-208 (2000).
- Squair, J. W., Gautier, M., Sofroniew, M. V., Courtine, G., Anderson, M. A. Engineering spinal cord repair. Current Opinion in Biotechnology. 72, 48-53 (2021).
- Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
- Grillner, S. The spinal locomotor CPG: A target after spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 97-108 (2002).
- Boulain, M., et al. Synergistic interaction between sensory inputs and propriospinal signalling underlying quadrupedal locomotion. Journal of Physiology. 599 (19), 4477-4496 (2021).
- Skarlatou, S., et al. Afadin signaling at the spinal neuroepithelium regulates central canal formation and gait selection. Cell Reports. 31 (10), 107741 (2020).
- Viala, D., Vidal, C. Evidence for distinct spinal locomotion generators supplying respectively fore-and hindlimbs in the rabbit. Brain Research. 155 (1), 182-186 (1978).
- Silver, J., Miller, J. H. Regeneration beyond the glial scar. Nature Reviews Neuroscience. 5 (2), 146-156 (2004).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
- Basso, D. M., et al. Basso mouse scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. Journal of Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantitative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an accelerating rotarod. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 20 (4), 302-304 (1968).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. The ladder rung walking task: A scoring system and its practical application. Journal of Visualized Experiments. (28), e1204 (2009).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: A new task to evaluate fore-and hindlimb stepping, placing, and coordination. Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
- Wallace, J. E., Krauter, E. E., Campbell, B. A. Motor and reflexive behavior in the aging rat. Journal of Gerontology. 35 (3), 364-370 (1980).
- Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington’s disease mutation. The Journal of Neuroscience. 19 (8), 3248-3257 (1999).
- Leblond, H., L’espérance, M., Orsal, D., Rossignol, S. Behavioral/systems/cognitive treadmill locomotion in the intact and spinal mouse. The Journal of Neuroscience. 23 (36), 11411-11419 (2003).
- Courtine, G., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nature Medicine. 14 (1), 69-74 (2008).
- Hamers, F. P. T., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. J. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
- Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13 (1), 50 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Stauch, K. L., et al. Applying the ratwalker system for gait analysis in a genetic rat model of Parkinson’s disease. Journal of Visualized Experiments. (167), e62002 (2021).
- Mendes, C. S., Rajendren, S. V., Bartos, I., Márka, S., Mann, R. S. Kinematic responses to changes in walking orientation and gravitational load in Drosophila melanogaster. PLoS One. 9 (10), e109204 (2014).
- Cabrita, A., et al. Motor dysfunction in Drosophila melanogaster as a biomarker for developmental neurotoxicity. iScience. 25 (7), 104541 (2022).
- Bishop, C. M. . Pattern Recognition and Machine Learning. , (2006).
- vander Maaten, L., Postma, E., vanden Herik, J. . Dimensionality reduction: A comparative review. , (2009).
- Courtine, G., et al. Performance of locomotion and foot grasping following a unilateral thoracic corticospinal tract lesion in monkeys (Macaca mulatta). Brain. 128 (10), 2338-2358 (2005).
- Drew, T., Jiang, W., Kably, B., Lavoie, S. Role of the motor cortex in the control of visually triggered gait modifications. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 74 (4), 426-442 (1996).
- Cheng, H., et al. Gait analysis of adult paraplegic rats after spinal cord repair. Experimental Neurology. 148 (2), 544-557 (1997).
- Thibaudier, Y., et al. Interlimb coordination during tied-belt and transverse split-belt locomotion before and after an incomplete spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 34 (9), 1751-1765 (2017).
- Bellardita, C., Kiehn, O. Phenotypic characterization of speed-associated gait changes in mice reveals modular organization of locomotor networks. Current Biology. 25 (11), 1426-1436 (2015).
- Machado, A. S., Marques, H. G., Duarte, D. F., Darmohray, D. M., Carey, M. R. Shared and specific signatures of locomotor ataxia in mutant mice. eLife. 9, 55356 (2020).
- Takeoka, A., Vollenweider, I., Courtine, G., Arber, S. Muscle spindle feedback directs locomotor recovery and circuit reorganization after spinal cord injury. Cell. 159 (7), 1626-1639 (2014).
