Utilizzo di MouseWalker per quantificare la disfunzione locomotoria in un modello murino di lesione del midollo spinale
Summary
Viene fornita una pipeline sperimentale per descrivere quantitativamente il modello locomotore dei topi che camminano liberamente utilizzando il toolbox MouseWalker (MW), che va dalle registrazioni video iniziali e dal tracciamento all’analisi post-quantificazione. Un modello di lesione da contusione del midollo spinale nei topi viene impiegato per dimostrare l’utilità del sistema MW.
Abstract
L’esecuzione di programmi motori complessi e altamente coordinati, come camminare e correre, dipende dall’attivazione ritmica dei circuiti spinali e sovraspinali. Dopo una lesione del midollo spinale toracico, la comunicazione con i circuiti a monte è compromessa. Questo, a sua volta, porta a una perdita di coordinazione, con un potenziale di recupero limitato. Quindi, per valutare meglio il grado di recupero dopo la somministrazione di farmaci o terapie, vi è la necessità di nuovi strumenti più dettagliati e accurati per quantificare l’andatura, la coordinazione degli arti e altri aspetti fini del comportamento locomotore in modelli animali di lesioni del midollo spinale. Diversi saggi sono stati sviluppati nel corso degli anni per valutare quantitativamente il comportamento di camminata libera nei roditori; Tuttavia, di solito mancano misurazioni dirette relative alle strategie di andatura, ai modelli di impronta e alla coordinazione. Per ovviare a queste carenze, viene fornita una versione aggiornata del MouseWalker, che combina una passerella di riflessione interna totale frustrata (fTIR) con un software di tracciamento e quantificazione. Questo sistema open-source è stato adattato per estrarre diversi output grafici e parametri cinematici, e una serie di strumenti di post-quantificazione può essere per analizzare i dati di output forniti. Questo manoscritto dimostra anche come questo metodo, unito a test comportamentali già stabiliti, descriva quantitativamente i deficit locomotori a seguito di lesioni del midollo spinale.
Introduction
L’efficace coordinazione di quattro arti non è esclusiva degli animali quadrupedi. La coordinazione degli arti anteriori-posteriori nell’uomo rimane importante per svolgere diversi compiti, come il nuoto e le alterazioni della velocità mentre si cammina1. Varie cinematiche degli arti2 e del programma motorio 1,3,4, così come i circuiti di feedback propriocettivo5, sono conservati tra l’uomo e altri mammiferi e dovrebbero essere considerati quando si analizzano le opzioni terapeutiche per i disturbi motori, come la lesione del midollo spinale (SCI)6,7,8.
Per camminare, diverse connessioni spinali dagli arti anteriori e posteriori devono essere correttamente cablate e attivate ritmicamente, il che richiede input dal cervello e feedback dal sistema somatosensoriale 2,9,10. Queste connessioni culminano nei generatori di pattern centrali (CPG), che si trovano a livello cervicale e lombare per gli arti anteriori e posteriori, rispettivamente 1,9,10. Spesso, dopo la SCI, l’interruzione della connettività neuronale e la formazione di una cicatrice gliale inibitoria12 limitano il recupero della funzione locomotoria, con esiti che variano dalla paralisi totale alla funzione ristretta di un gruppo di arti a seconda della gravità della lesione. Gli strumenti per quantificare con precisione la funzione locomotoria dopo SCI sono fondamentali per monitorare il recupero e valutare gli effetti dei trattamenti o di altri interventi clinici6.
Il test metrico standard per i modelli di contusione murina della SCI è la scala del topo Basso (BMS)13,14, un punteggio non parametrico che considera la stabilità del tronco, la posizione della coda, il passo plantare e la coordinazione degli arti anteriori-posteriori in un’arena di campo aperto. Anche se il BMS è estremamente affidabile per la maggior parte dei casi, richiede almeno due valutatori esperti per osservare tutti gli angoli del movimento animale al fine di tenere conto della variabilità naturale e ridurre i pregiudizi.
Sono stati sviluppati anche altri test per valutare quantitativamente le prestazioni motorie dopo SCI. Questi includono il test rotarod, che misura il tempo trascorso su un cilindro rotante15; la scala orizzontale, che misura il numero di ringhiere mancate e pinze positive16,17; e il beam walking test, che misura il tempo impiegato da un animale e il numero di fallimenti che fa quando attraversa una trave stretta18. Nonostante rifletta una combinazione di deficit motori, nessuno di questi test produce informazioni locomotorie dirette sulla coordinazione degli arti anteriori-posteriori.
Per analizzare in modo specifico e più approfondito il comportamento della camminata, sono stati sviluppati altri saggi per ricostruire i cicli di passi e le strategie di deambulazione. Un esempio è il test dell’impronta, in cui le zampe inchiostrate di un animale disegnano un motivo su un foglio di carta bianca19. Sebbene semplice nella sua esecuzione, estrarre parametri cinematici come la lunghezza del passo è ingombrante e impreciso. Inoltre, la mancanza di parametri dinamici, come la durata del ciclo di step o la coordinazione leg-timed, ne limita le applicazioni; In effetti, questi parametri dinamici possono essere acquisiti solo analizzando fotogramma per fotogramma video di roditori che camminano attraverso una superficie trasparente. Per gli studi SCI, i ricercatori hanno analizzato il comportamento a piedi da una vista laterale utilizzando un tapis roulant, compresa la ricostruzione del ciclo dei passi e la misurazione delle variazioni angolari di ciascuna articolazione della gamba 4,20,21. Anche se questo approccio può essere estremamente informativo6, rimane focalizzato su un insieme specifico di arti e manca di caratteristiche aggiuntive dell’andatura, come la coordinazione.
Per colmare queste lacune, Hamers e colleghi hanno sviluppato un test quantitativo basato su un sensore tattile ottico che utilizza la riflessione interna totale frustrata (fTIR)22. In questo metodo, la luce si propaga attraverso il vetro attraverso la riflessione interna, si disperde premendo la zampa e, infine, viene catturata da una telecamera ad alta velocità. Più recentemente, è stata resa disponibile una versione open source di questo metodo, chiamata MouseWalker, e questo approccio combina una passerella fTIR con un pacchetto software di tracciamento e quantificazione23. Utilizzando questo metodo, l’utente può estrarre un ampio set di parametri quantitativi, tra cui modelli di passo, spaziali e di andatura, posizionamento dell’impronta e coordinazione degli arti anteriori-posteriori, nonché output visivi, come i modelli di impronta (imitando il saggio della zampa inchiostrata6) o le fasi di posizione rispetto all’asse del corpo. È importante sottolineare che, a causa della sua natura open source, è possibile estrarre nuovi parametri aggiornando il pacchetto di script MATLAB.
Qui viene aggiornato l’assembly pubblicato in precedenza del sistema MouseWalker23 . Viene fornita una descrizione di come configurarlo, con tutti i passaggi necessari per ottenere la migliore qualità video, le condizioni di tracciamento e l’acquisizione dei parametri. Ulteriori strumenti di post-quantificazione sono inoltre condivisi per migliorare l’analisi del set di dati di output MouseWalker (MW). Infine, l’utilità di questo strumento è dimostrata ottenendo valori quantificabili per le prestazioni locomotorie generali, in particolare i cicli di step e la coordinazione arto anteriore-posteriore, in un contesto di lesione del midollo spinale (SCI).
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, il potenziale del metodo MouseWalker è dimostrato analizzando il comportamento locomotore dopo SCI. Fornisce nuove informazioni su specifiche alterazioni nei modelli di passo, impronta e andatura che altrimenti sarebbero sfuggite ad altri test standard. Oltre a fornire una versione aggiornata del pacchetto MW, gli strumenti di analisi dei dati sono descritti anche utilizzando gli script Python forniti (vedere il passaggio 5).
Poiché il MW genera un ampio set di dati e una raccolta di pa…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Laura Tucker e Natasa Loncarevic per i loro commenti sul manoscritto e il sostegno dato dalla Roditoria dell’Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes. Gli autori vogliono riconoscere il sostegno finanziario di Prémios Santa Casa Neurociências – Premio Melo e Castro per la ricerca sulle lesioni del midollo spinale (MC-36/2020) a L.S. e C.S.M. Questo lavoro è stato sostenuto da Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) (PTDC/BIA-COM/0151/2020), iNOVA4Health (UIDB/04462/2020 e UIDP/04462/2020) e LS4FUTURE (LA/P/0087/2020) a C.S.M. L.S. è stato supportato da un contratto CEEC Individual Principal Investigator (2021.02253.CEECIND). A.F.I. è stato sostenuto da una borsa di dottorato della FCT (2020.08168.BD). A.M.M. è stato supportato da una borsa di dottorato di FCT (PD / BD / 128445 / 2017). I.M. è stato supportato da una borsa di studio post-dottorato di FCT (SFRH / BPD / 118051 / 2016). D.N.S. è stato supportato da una borsa di dottorato di FCT (SFRH / BD / 138636 / 2018).
Materials
| 45º Mirror | |||
| 2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 16 cm height, 1 on each side | Misumi | ||
| 2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 23 cm, @ 45° , 1 on each side | Misumi | ||
| 1 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 83 cm long | Misumi | ||
| 87 x 23 cm mirror | General glass supplier | ||
| black cardboard filler | General stationery supplier | We used 2, one with 69 x 6 cm and another with 69 x 3cm to limit the reflection on the mirror | |
| Background backlight | |||
| 109 x 23 cm plexiglass (0.9525 cm thick) | General hardware supplier | ||
| 2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm), 20 cm long, 1 on each side | Misumi | ||
| multicolor LED strip | General hardware supplier | ||
| white opaque paper to cover the plexyglass | General stationery supplier | ||
| fTIR Support base and posts | |||
| 2 aluminum extrusion (4 x 4 cm), 100 cm height | Misumi | ||
| 60 x 30 cm metric breadboard | Edmund Optics | #54-641 | |
| M6 12 mm screws | Edmund Optics | ||
| M6 hex nuts and wahers | Edmund Optics | ||
| fTIR Walkway | |||
| 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | General hardware supplier | 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | |
| 109 cm long Base-U-channel aluminum with 1.6 cm height x 1.9 cm depth thick folds (to hold the plexyglass) | General hardware supplier | ||
| 2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm) 20 cm length, 1 on each side | Misumi | ||
| black cardboard filler | General stationery supplier | we used 2 fillers on each side to cover the limits of the plexyglass, avoiding bright edges | |
| 12 mm screws | Edmund Optics | M6 | |
| High speed camera (on a tripod) | |||
| Blackfly S USB3 | Blackfly | USB3 | This is a reccomendation. The requirement is to record at least 100 frames per second |
| Infinite Horizon Impactor | |||
| Infinite Horizon Impactor | Precision Systems and Instrumentation, LLC. | ||
| Lens | |||
| Nikkon AF Zoom-Nikkor 24-85mm | Nikkon | 2.8-4D IF | This lens is reccomended, however other lens can be used. Make sure it contains a large aperture (i.e., smaller F-stop values), to capture fTIR signals |
| Software | |||
| MATLAB R2022b | MathWorks | ||
| Python 3.9.13 | Python Software Foundation | ||
| Anaconda Navigator 2.1.4 | Anaconda, Inc. | ||
| Spyder 5.1.5 | Spyder Project Contributors | ||
| Walkway wall | |||
| 2 large rectagular acrilics with 100 x 15 cm | Any bricolage convenience store | ||
| 2 Trapezian acrilic laterals with 6-10 length x 15 cm height | Any bricolage convenience store | ||
| GitHub Materials | |||
| Folder name | URL | ||
| Boxplots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Boxplots | Script to create Boxplots | |
| Docs | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Docs | Additional documents | |
| Heatmap | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Heatmaps | Script to create heatmap | |
| Matlat script | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20Script | MouseWalker matlab script | |
| PCA | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plots | Script to perform Principal Component Analysis | |
| Raw data Plots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20Plots | Script to create Raw data plots | |
| Residual Analysis | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_Analysis | Code to compute residuals from Raw data |
Referências
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