Omurilik Yaralanmasının Bir Fare Modelinde Lokomotor Disfonksiyonu Ölçmek için MouseWalker'ı Kullanma
Summary
MouseWalker (MW) araç kutusunu kullanarak serbestçe yürüyen farelerin lokomotor modelini nicel olarak tanımlamak için ilk video kayıtlarından ve izlemeden niceleme sonrası analize kadar uzanan deneysel bir boru hattı sağlanmıştır. MW sisteminin yararlılığını göstermek için farelerde omurilik kontüzyon yaralanması modeli kullanılmıştır.
Abstract
Yürüme ve koşma gibi karmaşık ve yüksek derecede koordine edilmiş motor programlarının yürütülmesi, spinal ve supra-spinal devrelerin ritmik aktivasyonuna bağlıdır. Torasik omurilik yaralanmasından sonra, yukarı akış devreleri ile iletişim bozulur. Bu da, sınırlı iyileşme potansiyeli ile koordinasyon kaybına yol açar. Bu nedenle, ilaçların veya tedavilerin uygulanmasından sonra iyileşme derecesini daha iyi değerlendirmek için, omurilik yaralanmasının hayvan modellerinde yürüyüş, uzuv koordinasyonu ve lokomotor davranışın diğer ince yönlerini ölçmek için yeni, daha ayrıntılı ve doğru araçlara ihtiyaç vardır. Kemirgenlerde serbest yürüme davranışını nicel olarak değerlendirmek için yıllar içinde çeşitli testler geliştirilmiştir; Bununla birlikte, genellikle adım adım yürüme stratejileri, ayak izi kalıpları ve koordinasyon ile ilgili doğrudan ölçümlerden yoksundurlar. Bu eksiklikleri gidermek için, hayal kırıklığına uğramış bir toplam iç yansıma (fTIR) geçitini izleme ve niceleme yazılımı ile birleştiren MouseWalker’ın güncellenmiş bir sürümü sağlanmıştır. Bu açık kaynaklı sistem, çeşitli grafik çıktıları ve kinematik parametreleri çıkarmak için uyarlanmıştır ve sağlanan çıktı verilerini analiz etmek için bir dizi post-niceleme aracı olabilir. Bu makale ayrıca, halihazırda kurulmuş davranış testleriyle birlikte bu yöntemin, omurilik yaralanmasını takiben lokomotor eksiklikleri nicel olarak nasıl tanımladığını göstermektedir.
Introduction
Dört ekstremitenin etkili koordinasyonu, dörtlü hayvanlara özgü değildir. İnsanlarda ön ayak-arka bacak koordinasyonu, yüzme ve yürürken hız değişiklikleri gibi çeşitli görevleri yerine getirmek için önemini korumaktadır1. Çeşitli ekstremite kinematik2 ve motor programı 1,3,4’ün yanı sıra propriyoseptif geri besleme devreleri5, insanlar ve diğer memeliler arasında korunur ve omurilik yaralanması (SCI) gibi motor bozukluklar için terapötik seçenekleri analiz ederken göz önünde bulundurulmalıdır 6,7,8.
Yürümek için, ön ayaklardan ve arka bacaklardan birkaç omurga bağlantısının düzgün bir şekilde bağlanması ve ritmik olarak aktive edilmesi gerekir, bu da beyinden girdiler ve somatosensoriyel sistemden geri bildirim gerektirir 2,9,10. Bu bağlantılar, sırasıyla 1,9,10 olan ön ayaklar ve arka bacaklar için servikal ve lomber seviyede bulunan merkezi desen üreteçleri (CPG’ler) ile sonuçlanır. Genellikle, SCI’den sonra, nöronal bağlantının bozulması ve inhibitör bir glial skar12 oluşumu, lokomotor fonksiyonun iyileşmesini sınırlar ve sonuçlar, yaralanma şiddetine bağlı olarak toplam felçten bir grup ekstremitenin kısıtlı fonksiyonuna kadar değişir. SCI’den sonra lokomotor fonksiyonu hassas bir şekilde ölçmek için kullanılan araçlar, iyileşmeyi izlemek ve tedavilerin veya diğer klinik müdahalelerin etkilerini değerlendirmek için kritik öneme sahiptir6.
SCI’nin fare kontüzyon modelleri için standart metrik tahlil, açık alan arenasında gövde stabilitesini, kuyruk pozisyonunu, plantar adımlamayı ve ön ayak-arka bacak koordinasyonunu dikkate alan parametrik olmayan bir skor olan Basso fare ölçeği (BMS) 13,14’tür. BMS çoğu durumda son derece güvenilir olsa da, doğal değişkenliği hesaba katmak ve önyargıyı azaltmak için hayvan hareketinin tüm açılarını gözlemlemek için en az iki deneyimli puanlayıcı gerektirir.
SCI’dan sonra motor performansını nicel olarak değerlendirmek için başka testler de geliştirilmiştir. Bunlar arasında dönen bir silindir15 üzerinde harcanan zamanı ölçen rotarod testi; kaçırılan korkulukların sayısını ölçen yatay merdiven ve pozitif merdiven16,17; ve bir hayvanın dar bir kirişi geçerken aldığı süreyi ve yaptığı başarısızlık sayısını ölçen ışın yürüme testi18. Motor eksikliklerin bir kombinasyonunu yansıtmasına rağmen, bu testlerin hiçbiri ön ayak-arka bacak koordinasyonu hakkında doğrudan lokomotor bilgi üretmez.
Yürüme davranışını spesifik ve daha kapsamlı bir şekilde analiz etmek için, adım döngülerini ve yürüme stratejilerini yeniden yapılandırmak için başka testler geliştirilmiştir. Bir örnek, bir hayvanın mürekkepli pençelerinin bir beyaz kağıt19 sayfası üzerine bir desen çizdiği ayak izi testidir. Uygulanmasında basit olmasına rağmen, adım uzunluğu gibi kinematik parametrelerin çıkarılması hantal ve yanlıştır. Ayrıca, adım döngüsünün süresi veya bacak zamanlı koordinasyon gibi dinamik parametrelerin eksikliği, uygulamalarını sınırlar; Gerçekten de, bu dinamik parametreler yalnızca şeffaf bir yüzeyden geçen kemirgenlerin kare kare videolarını analiz ederek elde edilebilir. SCI çalışmaları için araştırmacılar, adım döngüsünü yeniden yapılandırmak ve her bir bacak ekleminin açısal varyasyonlarını ölçmek de dahil olmak üzere bir koşu bandı kullanarak yanal bir görünümden yürüme davranışını analiz ettiler 4,20,21. Bu yaklaşım son derecebilgilendirici 6 olsa da, belirli bir uzuv kümesine odaklanmaya devam eder ve koordinasyon gibi ek yürüyüş özelliklerinden yoksundur.
Bu boşlukları doldurmak için Hamers ve meslektaşları, hayal kırıklığına uğramış toplam iç yansıma (fTIR)22 kullanan optik bir dokunmatik sensöre dayanan nicel bir test geliştirdiler. Bu yöntemde, ışık iç yansıma yoluyla camdan yayılır, pençeye basıldığında dağılır ve son olarak yüksek hızlı bir kamera tarafından yakalanır. Daha yakın zamanlarda, bu yöntemin MouseWalker adı verilen açık kaynaklı bir sürümü kullanıma sunuldu ve bu yaklaşım bir fTIR yürüyüş yolunu bir izleme ve niceleme yazılım paketi23 ile birleştiriyor. Bu yöntemi kullanarak, kullanıcı adım, uzamsal ve yürüyüş kalıpları, ayak izi konumlandırma ve ön ayak-arka bacak koordinasyonunun yanı sıra ayak izi desenleri (mürekkepli pençe testi6’yı taklit ederek) veya vücut eksenine göre duruş aşamaları gibi görsel çıktılar da dahil olmak üzere çok sayıda nicel parametre çıkarabilir. Daha da önemlisi, açık kaynaklı doğası gereği, MATLAB komut dosyası paketi güncellenerek yeni parametreler çıkarılabilir.
Burada, MouseWalker23 sisteminin daha önce yayınlanan derlemesi güncellenir. En iyi video kalitesini, izleme koşullarını ve parametre alımını elde etmek için gereken tüm adımlarla birlikte nasıl ayarlanacağına dair bir açıklama sağlanır. MouseWalker (MW) çıktı veri kümesinin analizini geliştirmek için ek post-niceleme araçları da paylaşılır. Son olarak, bu aracın kullanışlılığı, omurilik yaralanması (SCI) bağlamında, genel lokomotor performans, özellikle adım döngüleri ve ön ayak-arka bacak koordinasyonu için ölçülebilir değerler elde edilerek gösterilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, MouseWalker yönteminin potansiyeli, SCI sonrası lokomotor davranışı analiz ederek gösterilmiştir. Adımlama, ayak izi ve yürüme modellerinde aksi takdirde diğer standart testler tarafından kaçırılacak belirli değişiklikler hakkında yeni bilgiler sağlar. MW paketinin güncellenmiş bir sürümünü sağlamanın yanı sıra, veri analiz araçları da sağlanan Python betikleri kullanılarak açıklanmaktadır (bkz. adım 5).
MW, büyük bir veri kümesi ve yüksek boyut…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Laura Tucker ve Natasa Loncarevic’e el yazması hakkındaki yorumları ve Instituto de Medicina Moleküler João Lobo Antunes Kemirgen Tesisi tarafından verilen destek için teşekkür eder. Yazarlar, Prémios Santa Casa Neurociências – Omurilik Yaralanması Araştırmaları için Melo e Castro Ödülü (MC-36/2020) tarafından L.S. ve C.S.M.’ye finansal destek sağlamak istiyor. Bu çalışma Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) (PTDC/BIA-COM/0151/2020), iNOVA4Health (UIDB/04462/2020 ve UIDP/04462/2020) ve LS4FUTURE (LA/P/0087/2020) tarafından C.S.M. L.S.’ye CEEC Bireysel Baş Araştırmacı sözleşmesi (2021.02253.CEECIND) ile desteklenmiştir. A.F.I., FCT’den (2020.08168.BD) doktora bursu ile desteklenmiştir. A.M.M., FCT’den doktora bursu ile desteklenmiştir (PD/BD/128445/2017). I.M., FCT’den doktora sonrası bir burs ile desteklenmiştir (SFRH / BPD / 118051 / 2016). D.N.S., FCT’den doktora bursu ile desteklenmiştir (SFRH / BD / 138636 / 2018).
Materials
| 45º Mirror | |||
| 2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 16 cm height, 1 on each side | Misumi | ||
| 2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 23 cm, @ 45° , 1 on each side | Misumi | ||
| 1 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 83 cm long | Misumi | ||
| 87 x 23 cm mirror | General glass supplier | ||
| black cardboard filler | General stationery supplier | We used 2, one with 69 x 6 cm and another with 69 x 3cm to limit the reflection on the mirror | |
| Background backlight | |||
| 109 x 23 cm plexiglass (0.9525 cm thick) | General hardware supplier | ||
| 2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm), 20 cm long, 1 on each side | Misumi | ||
| multicolor LED strip | General hardware supplier | ||
| white opaque paper to cover the plexyglass | General stationery supplier | ||
| fTIR Support base and posts | |||
| 2 aluminum extrusion (4 x 4 cm), 100 cm height | Misumi | ||
| 60 x 30 cm metric breadboard | Edmund Optics | #54-641 | |
| M6 12 mm screws | Edmund Optics | ||
| M6 hex nuts and wahers | Edmund Optics | ||
| fTIR Walkway | |||
| 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | General hardware supplier | 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | |
| 109 cm long Base-U-channel aluminum with 1.6 cm height x 1.9 cm depth thick folds (to hold the plexyglass) | General hardware supplier | ||
| 2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm) 20 cm length, 1 on each side | Misumi | ||
| black cardboard filler | General stationery supplier | we used 2 fillers on each side to cover the limits of the plexyglass, avoiding bright edges | |
| 12 mm screws | Edmund Optics | M6 | |
| High speed camera (on a tripod) | |||
| Blackfly S USB3 | Blackfly | USB3 | This is a reccomendation. The requirement is to record at least 100 frames per second |
| Infinite Horizon Impactor | |||
| Infinite Horizon Impactor | Precision Systems and Instrumentation, LLC. | ||
| Lens | |||
| Nikkon AF Zoom-Nikkor 24-85mm | Nikkon | 2.8-4D IF | This lens is reccomended, however other lens can be used. Make sure it contains a large aperture (i.e., smaller F-stop values), to capture fTIR signals |
| Software | |||
| MATLAB R2022b | MathWorks | ||
| Python 3.9.13 | Python Software Foundation | ||
| Anaconda Navigator 2.1.4 | Anaconda, Inc. | ||
| Spyder 5.1.5 | Spyder Project Contributors | ||
| Walkway wall | |||
| 2 large rectagular acrilics with 100 x 15 cm | Any bricolage convenience store | ||
| 2 Trapezian acrilic laterals with 6-10 length x 15 cm height | Any bricolage convenience store | ||
| GitHub Materials | |||
| Folder name | URL | ||
| Boxplots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Boxplots | Script to create Boxplots | |
| Docs | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Docs | Additional documents | |
| Heatmap | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Heatmaps | Script to create heatmap | |
| Matlat script | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20Script | MouseWalker matlab script | |
| PCA | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plots | Script to perform Principal Component Analysis | |
| Raw data Plots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20Plots | Script to create Raw data plots | |
| Residual Analysis | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_Analysis | Code to compute residuals from Raw data |
Referências
- Frigon, A. The neural control of interlimb coordination during mammalian locomotion. Journal of Neurophysiology. 117 (6), 2224-2241 (2017).
- Grillner, S. Biological pattern generation: The cellular and computational logic of networks in motion. Neuron. 52 (5), 751-766 (2006).
- Dominici, N., et al. locomotor primitives in newborn babies and their development. Science. 334 (6058), 997-999 (2011).
- Courtine, G., et al. Kinematic and EMG determinants in quadrupedal locomotion of a non-human primate (Rhesus). Journal of Neurophysiology. 93 (6), 3127-3145 (2005).
- Clarac, F., Cattaert, D., le Ray, D. Central control components of a ‘simple’ stretch reflex. Trends Neuroscience. 23 (5), 199-208 (2000).
- Squair, J. W., Gautier, M., Sofroniew, M. V., Courtine, G., Anderson, M. A. Engineering spinal cord repair. Current Opinion in Biotechnology. 72, 48-53 (2021).
- Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
- Grillner, S. The spinal locomotor CPG: A target after spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 97-108 (2002).
- Boulain, M., et al. Synergistic interaction between sensory inputs and propriospinal signalling underlying quadrupedal locomotion. Journal of Physiology. 599 (19), 4477-4496 (2021).
- Skarlatou, S., et al. Afadin signaling at the spinal neuroepithelium regulates central canal formation and gait selection. Cell Reports. 31 (10), 107741 (2020).
- Viala, D., Vidal, C. Evidence for distinct spinal locomotion generators supplying respectively fore-and hindlimbs in the rabbit. Brain Research. 155 (1), 182-186 (1978).
- Silver, J., Miller, J. H. Regeneration beyond the glial scar. Nature Reviews Neuroscience. 5 (2), 146-156 (2004).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
- Basso, D. M., et al. Basso mouse scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. Journal of Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantitative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an accelerating rotarod. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 20 (4), 302-304 (1968).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. The ladder rung walking task: A scoring system and its practical application. Journal of Visualized Experiments. (28), e1204 (2009).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: A new task to evaluate fore-and hindlimb stepping, placing, and coordination. Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
- Wallace, J. E., Krauter, E. E., Campbell, B. A. Motor and reflexive behavior in the aging rat. Journal of Gerontology. 35 (3), 364-370 (1980).
- Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington’s disease mutation. The Journal of Neuroscience. 19 (8), 3248-3257 (1999).
- Leblond, H., L’espérance, M., Orsal, D., Rossignol, S. Behavioral/systems/cognitive treadmill locomotion in the intact and spinal mouse. The Journal of Neuroscience. 23 (36), 11411-11419 (2003).
- Courtine, G., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nature Medicine. 14 (1), 69-74 (2008).
- Hamers, F. P. T., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. J. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
- Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13 (1), 50 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Stauch, K. L., et al. Applying the ratwalker system for gait analysis in a genetic rat model of Parkinson’s disease. Journal of Visualized Experiments. (167), e62002 (2021).
- Mendes, C. S., Rajendren, S. V., Bartos, I., Márka, S., Mann, R. S. Kinematic responses to changes in walking orientation and gravitational load in Drosophila melanogaster. PLoS One. 9 (10), e109204 (2014).
- Cabrita, A., et al. Motor dysfunction in Drosophila melanogaster as a biomarker for developmental neurotoxicity. iScience. 25 (7), 104541 (2022).
- Bishop, C. M. . Pattern Recognition and Machine Learning. , (2006).
- vander Maaten, L., Postma, E., vanden Herik, J. . Dimensionality reduction: A comparative review. , (2009).
- Courtine, G., et al. Performance of locomotion and foot grasping following a unilateral thoracic corticospinal tract lesion in monkeys (Macaca mulatta). Brain. 128 (10), 2338-2358 (2005).
- Drew, T., Jiang, W., Kably, B., Lavoie, S. Role of the motor cortex in the control of visually triggered gait modifications. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 74 (4), 426-442 (1996).
- Cheng, H., et al. Gait analysis of adult paraplegic rats after spinal cord repair. Experimental Neurology. 148 (2), 544-557 (1997).
- Thibaudier, Y., et al. Interlimb coordination during tied-belt and transverse split-belt locomotion before and after an incomplete spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 34 (9), 1751-1765 (2017).
- Bellardita, C., Kiehn, O. Phenotypic characterization of speed-associated gait changes in mice reveals modular organization of locomotor networks. Current Biology. 25 (11), 1426-1436 (2015).
- Machado, A. S., Marques, H. G., Duarte, D. F., Darmohray, D. M., Carey, M. R. Shared and specific signatures of locomotor ataxia in mutant mice. eLife. 9, 55356 (2020).
- Takeoka, A., Vollenweider, I., Courtine, G., Arber, S. Muscle spindle feedback directs locomotor recovery and circuit reorganization after spinal cord injury. Cell. 159 (7), 1626-1639 (2014).
