I denna artikel beskrivs ett protokoll för manuell tyramidsignalförstärkning (TSA) multiplex immunofluorescens (mIF) kombinerat med bildanalys och rumslig analys. Detta protokoll kan användas med formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) sektioner för färgning av två till sex antigener per glas beroende på vilken glidskanner som finns i laboratoriet.
Tumörmikromiljön (TME) består av en uppsjö av olika celltyper, såsom cytotoxiska immunceller och immunmodulerande celler. Beroende på dess sammansättning och interaktionerna mellan cancerceller och peritumörceller kan TME påverka cancerprogressionen. Karakteriseringen av tumörer och deras komplexa mikromiljö kan förbättra förståelsen för cancersjukdomar och kan hjälpa forskare och kliniker att upptäcka nya biomarkörer.
Vi utvecklade nyligen flera multiplex immunofluorescenspaneler (mIF) baserade på tyramidsignalamplifiering (TSA) för karakterisering av TME i kolorektal cancer, skivepitelcancer i huvud och hals, melanom och lungcancer. När färgningen och skanningen av motsvarande paneler är klar analyseras proverna på en bildanalysprogramvara. Den rumsliga positionen och färgningen av varje cell exporteras sedan från denna kvantifieringsprogramvara till R. Vi utvecklade R-skript som gör det möjligt för oss att inte bara analysera densiteten hos varje celltyp i flera tumörkompartment (t.ex. tumörens centrum, tumörens marginal och stroma) utan också att utföra avståndsbaserade analyser mellan olika celltyper.
Detta speciella arbetsflöde lägger till en rumslig dimension till den klassiska densitetsanalysen som redan rutinmässigt utförs för flera markörer. mIF-analys kan göra det möjligt för forskare att få en bättre förståelse för den komplexa interaktionen mellan cancerceller och TME och att upptäcka nya prediktiva biomarkörer för svar på behandlingar, såsom immuncheckpointhämmare och riktade terapier.
Med utvecklingen av riktade terapier och immuncheckpointhämmare har det blivit av yttersta vikt att bättre karakterisera interaktionerna mellan cancerceller och deras tumörmikromiljö, och detta är för närvarande ett viktigt område för translationell forskning. TME består av en uppsjö av olika celltyper, med en balans av immuncytotoxiska celler riktade mot cancercellerna och immunmodulerande celler som kan gynna tumörtillväxt och invasivitet 1,2,3,4. Karakteriseringen av denna komplexa miljö kan förbättra förståelsen av cancersjukdomar och kan hjälpa forskare och kliniker att upptäcka nya prediktiva och prognostiska biomarkörer för att bättre välja patienter för framtida behandling 5,6. Till exempel utvecklade Galon och hans team Immunoscore, som är en reproducerbar poängmetod som kan användas som en prediktiv biomarkör. Immunoscore beräknas med hjälp av densiteten hos CD3 + och CD8 + T-celler i den invasiva marginalen och i mitten av tumören 7,8.
Under de senaste decennierna har kommersiella lösningar för mIF utvecklats, men dessa är ofta dyra och utformade för specifika paneler av antigener. För att övervinna behovet av specifika paneler av antigener i akademisk och translationell forskning utvecklade vi en kostnadseffektiv metod för att utföra mIF på FFPE-tumörsektioner, vilket möjliggör färgning av två till sex antigener tillsatta till cellkärnorna motfärgning på humana och musprover.
När hela vävnadssnittet är färgat och skannat med en fluorescensbildskanner kan proverna analyseras av flera bildanalysprogram som stöder stora pyramidala dataset. Slutligen kan rådata användas i en miljö för statistisk databehandling och grafik som R-programvaran (v.4.0.2) för att utföra densitets- och rumsbaserade analyser.
Ett protokoll optimerat för färgning med fem markörer, samt knep och tips för att optimera nya paneler, presenteras i detta manuskript. Dessutom förklaras detaljerade steg i bildanalysen och R-funktionerna som används för den statistiska och rumsliga analysen.
De viktigaste parametrarna att ta hänsyn till för att optimera multiplexfärgning är utspädningen, specificiteten och antigenhämtningen som används för varje primär antikropp. Innan ett multiplexprotokoll påbörjas måste varje primär antikropps optimala utspädning och optimala epitophämtning (pH 6 eller pH 9) testas med kromogen färgning (DAB). Vi rekommenderar att du testar tre utspädningar för varje antigenhämtningsbuffert: den utspädning som vanligtvis specificeras av varumärket som kommersialiserar antikroppen, samma utspädning uppdelad två gånger och samma utspädning multiplicerad tvåfaldig (figur 8). Att välja rätt utspädning är ett mycket viktigt steg för att verifiera antikroppsspecificiteten och optimera signal-brusförhållandet (SNR) för färgningen. Efter att ha valt rätt utspädning i DAB bör samma utspädning testas för varje primär antikropp med uniplex TSA. När utspädnings- och epitophämtningsbufferten har valts för varje antigenfärgning är det också viktigt att ställa in multiplexsekvensen korrekt. Specifikt är vissa antigener bättre färgade vid första positionen och andra vid den sista positionen. Vi rekommenderar att du testar multiplexmärkningen med alla möjliga ordningspermutationer för att välja vilken antigenfärgning som ska komma först, andra etc. Detta är också ett mycket viktigt steg eftersom vissa ömtåliga antigener kan brytas ned efter flera omgångar av epitophämtning, och vissa antigener färgas bättre efter flera omgångar av epitophämtning. Till exempel är SNR alltid högre i den sista positionen för CD3 och i den första positionen för PD-1-färgning. Dessutom kan färgningen av flera samlokaliserade antigener hindras av en paraplyeffekt (mättnaden av tyramidreaktiva platser). Detta kan dämpas genom att minska tyramidkoncentrationen. När uttrycket av ett antigen är betingat av uttrycket av ett annat (CD8 endast närvarande på CD3-uttryckande T-celler), rekommenderar vi att färga antigenet med det bredaste uttrycket (CD3 i detta fall) efter det andra. Slutligen är det också ett viktigt steg att välja rätt fluorokrom för varje antigenfärgning enligt skannerns specificiteter för att undvika korsdetektion.
De stora fördelarna med denna teknik är förstärkningen och signal-brusförhållandet som erhålls. Denna teknik har emellertid en begränsning, vilket är att färgningen är sekventiell och fluorokromerna är kovalent bundna till vävnaden. Men efter att ha utfört alla tyramidsignalförstärkningsrundor är det också möjligt att lägga till en sista färgning med en sekundär antikropp direkt kopplad till en fluorokrom (ingen TSA). I vissa paneler använde vi den här metoden för att lägga till färgning i 750-kanalen. Detta var nödvändigt eftersom ingen tyramid-AF750 var kommersiellt tillgänglig vid den tiden. Observera att exponeringstiden (under skanningen) av antigenet färgat med AF750 kommer att vara mycket längre än för de andra antigenerna färgade med TSA. I så fall rekommenderar vi färgning av ett högt uttryckt protein som cytokeratin eller ökning av koncentrationen av den primära antikroppen. Genom att göra det är det möjligt att färga högst fem till sex antigener per glas i en sats beroende på fluorescensskannern.
I motsats använder flera kommersiellt tillgängliga tekniker seriell färgning med flera omgångar av färgning, skanning och strippning eller fotoblekning för att förbättra antalet antigener som kan färgas på en enda vävnadssektion. Dessa tekniker är emellertid ofta tidskrävande, dyra, har ingen signalförstärkning, kräver avancerade beräkningssteg för att slå samman seriella skanningar korrekt och kan enligt vår erfarenhet orsaka irreversibel vävnadsskada på grund av de många procedurstegen. Det har dock rapporterats att upp till 30 antigener skulle kunna färgas på en enda vävnad med denna metod14.
Sammanfattningsvis är vår metod en robust, reproducerbar, lättanvänd och kostnadseffektiv immunohistofluorescensteknik som kan användas i alla laboratorier som har en fluorescensbildskanner. Alla kommersialiserade primära antikroppar som är lämpliga för IHC kan användas, och panelerna är inte specifika för några kommersiella kit. Bildanalysen kan göras på flera olika program, inklusive program med öppen källkod som QuPath och R. Vi tror dock att denna metod till och med kan förbättras i framtiden för stora antigenpaneler, vilket möjliggör seriefärgning / skanning av samma glas med olika paneler av antigener och med fördelen av signalförstärkning.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Dr. Derouane F för hennes hjälp och stöd. Nicolas Huyghe är forskare med stöd av ett bidrag från den belgiska nationella fonden för vetenskaplig forskning (Télévie/FNRS 7460918F).
anti-CD3 primary antibody | Abcam | ab16669 | rabbit monocolonal |
anti-CD8 primary antibody | DAKO | M710301 | mouse monoclonal |
anti-hPanCK primary antibody | DAKO | M3515 | mouse monoclonal |
anti-PD-1 primary antibody | Cell Signalling | D4W2J | rabbit monocolonal |
anti-PD-L1 primary antibody | Cell Signalling | 13684 | rabbit monocolonal |
anti-RORC primary antibody | Sigma | MABF81 | mouse monoclonal |
ATTO-425 | ATTOtec | ||
Axioscan Z1 | Zeiss | Light source: Colibri 7 (385, 430, 475, 555, 590, 630, 735 nm) Filtersets: Excitation 379/34 – beam splitter 409 – emission 440/40; Excitation 438/24 – beam splitter 458 – emission 483/32; Excitation 490/20 – beam splitter 505 – emission 525/20; Excitation 546/10 – beam splitter 556 – emission 572/23; Excitation 592/21 – beam splitter 610 – emission 630/30; Excitation 635/18 – beam splitter 652 – emission 680/42; Excitation 735/40 – beam splitter QBS 405 + 493 + 611 + 762 – emission QBP 425/30 + 524/51 + 634/38 + 785/38; Objective: Plan-Apochromat 20x/0.8; Camera : Orca Flash 4.0 V3 | |
Borosilicate Cover Glass | VWR | 631-0146 | |
Envision+ anti-mouse | DAKO | K4001 | |
Envision+ anti-rabbit | DAKO | K4003 | |
Fluorescence mounting medium | DAKO | S3023 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 750 | ThermoFischer | A-21037 | |
HALO software | Indicalabs | ||
Hoescht | Sigma | 14533 | |
Superfrost plus microscope slides | Fisherscientific/Epredia | 10149870 | |
Tyramide-AF488 | ThermoFischer | B40953 | |
Tyramide-AF555 | ThermoFischer | B04955 | |
Tyramide-AF647 | ThermoFischer | B04958 |