Gedecellulariseerde van appel afgeleide steigers voor botweefselengineering in vitro pt in vivo

Summary

In deze studie beschrijven we methoden voor decellularisatie, fysieke karakterisering, beeldvorming en in vivo implantatie van plantaardige biomaterialen, evenals methoden voor celzaaiing en differentiatie in de steigers. De beschreven methoden maken het mogelijk om plantaardige biomaterialen te evalueren voor toepassingen op het gebied van botweefseltechnologie.

Abstract

Biomaterialen van plantaardige cellulose zijn gebruikt in verschillende toepassingen voor weefselmanipulatie. In vivo studies hebben de opmerkelijke biocompatibiliteit aangetoond van steigers gemaakt van cellulose afkomstig van natuurlijke bronnen. Bovendien bezitten deze steigers structurele kenmerken die relevant zijn voor meerdere weefsels, en bevorderen ze de invasie en proliferatie van zoogdiercellen. Recent onderzoek met behulp van gedecellulariseerd appelhypanthiumweefsel heeft de gelijkenis van de poriegrootte met die van trabeculair bot aangetoond, evenals het vermogen om osteogene differentiatie effectief te ondersteunen. De huidige studie onderzocht verder het potentieel van van appel afgeleide cellulosesteigers voor botweefselmanipulatie (AHO) toepassingen en evalueerde hun in vitro pt in vivo mechanische eigenschappen. MC3T3-E1 preosteoblasten werden gezaaid in van appels afgeleide cellulosesteigers die vervolgens werden beoordeeld op hun osteogene potentieel en mechanische eigenschappen. Alkalische fosfatase en alizarinerode S-kleuring bevestigden osteogene differentiatie in steigers gekweekt in differentiatiemedium. Histologisch onderzoek toonde wijdverspreide celinvasie en mineralisatie over de steigers aan. Scanning-elektronenmicroscopie (SEM) onthulde minerale aggregaten op het oppervlak van de steigers en energiedispersieve spectroscopie (EDS) bevestigde de aanwezigheid van fosfaat- en calciumelementen. Ondanks een significante toename van de Young-modulus na celdifferentiatie, bleef deze echter lager dan die van gezond botweefsel. In vivo studies toonden celinfiltratie en afzetting van extracellulaire matrix in de gedecellulariseerde van appel afgeleide steigers na 8 weken implantatie in calvaria van ratten. Bovendien was de kracht die nodig was om de steigers van het botdefect te verwijderen vergelijkbaar met de eerder gerapporteerde fractuurbelasting van inheems calvariaal bot. Over het algemeen bevestigt deze studie dat van appel afgeleide cellulose een veelbelovende kandidaat is voor AHO-toepassingen. Het verschil tussen de mechanische eigenschappen en die van gezond botweefsel kan de toepassing ervan echter beperken tot scenario’s met een lage belasting. Aanvullende structurele re-engineering en optimalisatie kunnen nodig zijn om de mechanische eigenschappen van van appel afgeleide cellulosesteigers voor dragende toepassingen te verbeteren.

Introduction

Grote botdefecten veroorzaakt door een verwonding of ziekte vereisen vaak biomateriaaltransplantaten voor volledige regeneratie¹. De huidige technieken die zijn ontworpen om de regeneratie van botweefsel te verbeteren, maken regelmatig gebruik van autologe, allogene, xenogene of synthetische transplantaten². Voor autologe bottransplantatie, beschouwd als de “gouden standaard” -transplantatiepraktijk om grote botdefecten te herstellen, wordt bot uit de patiënt gehaald. Deze entprocedure heeft echter verschillende nadelen, waaronder beperkingen van grootte en vorm, beschikbaarheid van weefsel en^{morbiditeit op} de bemonsteringsplaats3. Bovendien zijn autologe transplantatieprocedures vatbaar voor postoperatieve wondinfecties, daaropvolgende fracturen, hematoomvorming op de bemonsterings- of gereconstrueerde plaats en postoperatieve pijn⁴. Bone tissue engineering (AHO) biedt een potentieel alternatief voor conventionele bottransplantatiemethoden⁵. Het combineert structurele biomaterialen en cellen om nieuw functioneel botweefsel op te bouwen. Bij het ontwerpen van biomaterialen voor BTE is het van cruciaal belang om een macroporeuze structuur, oppervlaktechemie die celhechting bevordert en mechanische eigenschappen te combineren die sterk lijken op die van natuurlijk bot⁶. Eerder onderzoek heeft aangetoond dat de ideale poriegrootte en elasticiteitsmodulus voor biomaterialen die in AHO worden gebruikt, respectievelijk ongeveer 100-200 μm⁷ en 0,1-20 GPa zijn, afhankelijk van de entplaats⁸. Bovendien zijn de porositeit en poriëninterconnectiviteit van de steigers kritische factoren die van invloed zijn op celmigratie, diffusie van voedingsstoffen en angiogenese⁸.

BTE heeft veelbelovende resultaten laten zien met verschillende biomaterialen die zijn ontwikkeld en geëvalueerd als alternatieve opties voor bottransplantaten. Sommige van deze biomaterialen zijn osteoinductieve materialen, hybride materialen en geavanceerde hydrogels⁸. Osteoinductieve materialen stimuleren de ontwikkeling van nieuw gevormde botstructuren. Hybride materialen zijn samengesteld uit synthetische en/of natuurlijke polymeren⁸. Geavanceerde hydrogels bootsen de extracellulaire matrix (ECM) na en zijn in staat om de nodige bioactieve factoren af te geven om de integratie van botweefsel te bevorderen⁸. Hydroxyapatiet is een traditioneel materiaal en een veel voorkomende keuze voor AHO vanwege de samenstelling en biocompatibiliteit⁹. Bioactief glas is een ander type biomateriaal voor AHO, waarvan is aangetoond dat het specifieke celreacties stimuleert om genen te activeren die nodig zijn voor osteogenese^10,11. Biologisch afbreekbare polymeren, waaronder poly(glycolzuur) en poly(melkzuur), zijn ook op grote schaal gebruikt in AHO-toepassingen¹². Ten slotte hebben natuurlijke of natuurlijk afgeleide polymeren zoals chitosan, chitine en bacteriële cellulose ook bemoedigende resultaten voor BTE¹³ aangetoond. Hoewel zowel synthetische als natuurlijke polymeren potentieel hebben voor AHO, vereist de ontwikkeling van een functionele steiger met de gewenste macrostructuur doorgaans uitgebreide protocollen.

Omgekeerd kunnen inheemse macroscopische cellulosestructuren gemakkelijk worden afgeleid uit diverse planten en onze onderzoeksgroep heeft eerder de toepasbaarheid aangetoond van op cellulose gebaseerde steigers afgeleid van planten op verschillende weefselreconstructies. Na een eenvoudige behandeling met oppervlakteactieve stoffen hebben we de inherente structuur van het plantmateriaal benut en het potentieel ervan als veelzijdig biomateriaal benadrukt¹⁴. Bovendien kunnen deze op cellulose gebaseerde steigers worden gebruikt voor in vitro celkweektoepassingen van zoogdieren¹⁴, zijn ze biocompatibel en ondersteunen ze spontane subcutane vascularisatie 14,15,16,17. Zowel onze onderzoeksgroep als anderen hebben aangetoond dat deze steigers kunnen worden verkregen uit specifieke planten op basis van de beoogde toepassing 14,15,16,17,18,19,20. De vasculaire structuur die wordt waargenomen in plantenstengels en -bladeren vertoont bijvoorbeeld een opvallende gelijkenis met de structuur die wordt aangetroffen in dierlijke weefsels¹⁹. Bovendien kunnen cellulosesteigers afkomstig van planten gemakkelijk worden gevormd en onderworpen aan biochemische modificaties aan het oppervlak om de gewenste eigenschappen te bereiken¹⁶. In een recente studie hebben we een zoutbuffer opgenomen tijdens het decellularisatieproces, wat leidt tot een verbeterde celhechting die zowel in vitro als in vivo wordt waargenomen¹⁶. In dezelfde studie toonden we de toepasbaarheid van plantaardige cellulosesteigers in composiet biomaterialen aan door hydrogels op het oppervlak van de steigers te gieten. In recente studies is aangetoond dat de functionalisering van plantaardige steigers hun effectiviteit^verbetert18. Een studie uitgevoerd door Fontana et al. (2017) onthulde bijvoorbeeld dat de hechting van menselijke dermale fibroblasten werd ondersteund door RGD-gecoate gedecellulariseerde stengels, terwijl niet-gecoate stengels niet hetzelfde vermogen vertoonden¹⁸. Bovendien toonden de auteurs ook aan dat gemodificeerde gesimuleerde lichaamsvloeistof kan worden gebruikt om gedecellulariseerde plantenstengels kunstmatig te mineraliseren. In recentere studies onderzochten we het concept van mechanosensitieve osteogenese in plantaardige cellulosesteigers en beoordeelden we hun potentieel voor BTE^17,20. Bovendien gebruikten Lee et al. (2019) plantaardige steigers om botachtige weefsels te cultiveren in een in vitro-setting ²¹. Door middel van uitgebreide evaluaties van verschillende plantaardige bronnen, identificeerden de auteurs van appels afgeleide steigers als de meest optimale voor de kweek en differentiatie van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC’s). Bovendien stelden de auteurs voor dat de structurele en mechanische kenmerken van de van appels afgeleide steigers een cruciale rol spelen bij hun geschiktheid voor het beoogde doel. Omdat het de eerste van planten afgeleide steigers zijn die worden geïmplementeerd in weefselmanipulatietoepassingen, is uitgebreid aangetoond dat van appel afgeleide steigers een opvallend vergelijkbare architectuur hebben als die van menselijk bot, met name in termen van hun onderling verbonden poriën variërend van 100 tot 200 μm in diameter^14,21.

In de huidige studie onderzochten we verder het potentieel van van appels afgeleide cellulosesteigers voor AHO en voerden we een analyse uit van hun mechanische eigenschappen, zowel in vitro als in vivo. Hoewel er studies zijn gedaan naar het potentieel van van appels afgeleide steigers voor BTE 17,20,21, zijn hun mechanische eigenschappen onvoldoende onderzocht. De resultaten toonden wildverspreide invasie en osteogene differentiatie van MC3T3-E1 preosteoblasten gezaaid in steigers die gedurende 4 weken in differentiatiemedium werden gekweekt. De Young-modulus van deze steigers was 192,0 ± 16,6 kPa, wat aanzienlijk hoger was dan die van de blanco steigers (steigers zonder gezaaide cellen) (31,6 ± 4,8 kPa) en de met cellen bezaaide steigers gekweekt in niet-differentiatiemedium (24,1 ± 8,8 kPa). Er moet echter worden opgemerkt dat de Young-modulus van gezond menselijk botweefsel doorgaans binnen het bereik van 0.1-2 GPa valt voor trabeculair bot en ongeveer 15-20 GPa voor corticaal bot⁸. Desalniettemin, na een implantatie van 8 weken in een knaagdier calvariaal defect, leken de met cellen gezaaide steigers goed geïntegreerd te zijn in het omringende bot, zoals blijkt uit een gemiddelde piekkracht van 113,6 N ± 18,2 N in push-outtests, wat vergelijkbaar is met de eerder gerapporteerde fractuurbelasting van native calvariaal bot²². Over het algemeen zijn de resultaten van deze studie veelbelovend, met name voor niet-dragende toepassingen. Van appel afgeleide cellulosesteigers bezitten momenteel echter niet de nodige mechanische eigenschappen om precies overeen te komen met het omringende botweefsel op een implantaatplaats. Daarom is verdere ontwikkeling nodig om het volledige potentieel van deze steigers te ontsluiten.

Protocol

De experimentele protocollen werden beoordeeld en goedgekeurd door de Animal Care Committee van de Universiteit van Ottawa. 1. Voorbereiding van de steiger Snijd McIntosh-appels (Canada Fancy) met een mandolinesnijder in plakken van 8 mm dik. Snijd het hypanthiumweefsel van de appelschijfjes in vierkanten van 5 mm x 5 mm. Plaats de vierkante monsters gedurende 2 dagen in 0,1% natriumdodecylsulfaat (SDS). Was de gedecellulariseerde monsters met ged…

Representative Results

Meting van de poriegrootte, celverdeling en in vitro mineralisatie (Figuur 1 en Figuur 2)Volledige verwijdering van native cellulaire componenten van de appelweefselsteigers werd bereikt na behandeling van de steigers met SDS en CaCl2 (Figuur 1A). De steigers vertoonden een zeer poreuze structuur, die werd bevestigd met behulp van confocale microscopie. De kwantificering van de beelden toonde…

Discussion

Verschillende in vitro pt in vivo studies hebben de biocompatibiliteit van plantaardige cellulose en het mogelijke gebruik ervan in tissue engineering aangetoond 14,15,16,18,19,20, meer bepaald voor het hosten van osteogene differentiatie ^20,21. De …

Materials

4′,6-diamidino-2-phenylindole	ThermoFisher	D1306	DAPI
5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate and nitro-blue tetrazolium	Sigma-Aldrich	B5655	BCIP/NBT
Alizarin red S	Sigma-Aldrich	A5533	ARS
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4403	Cell Culture
Calcium Chloride	ThermoFisher	AA12316	CaCl2
Calcofluor White	Sigma-Aldrich	18909
Dental drill			Surgical tool
Ethanol	ThermoFisher	615095000
Fetal bovine serum	Hyclone Laboratories	SH30396	FBS
Formalin	Sigma-Aldrich	HT501128	10% Formalin
Goldner's trichrome stain	Sigma-Aldrich	1.00485	GTC
Hematoxylin and eosin stain	Fisher Scientific	NC1470670	H&E
High-speed resonant confocal laser scanning microscope	Nikon	Nikon Ti-E A1-R
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
ImageJ software	National Institutes of Health
Irrigation saline	Baxter	JF7123	0.9% NaCl
MC3T3-E1 Subclone 4 cells	ATCC	CRL-2593	Pre-osteoblast cells
McIntosh apples			Canada Fancy grade
Methyl methacrylate	Sigma-Aldrich	M55909	Histological embedding
Minimum Essential Medium	ThermoFisher	M0894	α-MEM
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	O4042	4%; PFA
Penicillin/Streptomycin	Hyclone Laboratories	SV30010	Cell Culture
Periodic acid	Sigma-Aldrich	375810
Phosphate buffered saline	Hyclone Laboratories	2810305	PBS; without Ca2+ and Mg2+
Propidium iodide	Invitrogen	p3566
Scanning electron microscope	JEOL	JSM-7500F FESEM	SEM and EDS
Slide scanner microscope	Zeiss	AXIOVERT 40 CFL
Sodium dodecyl sulfate	Fisher Scientific	BP166	SDS
Sodium metabisulphite	Sigma-Aldrich	31448
Sodium phosphate	ThermoFisher	BP329
Sprague-Dawley rats	Charles-River Laboratories	400	Male
Sutures	Ethicon	J494G	4-0
Trephine	ACE Surgical Supply Co	583-0182	5-mm diameter
Triton-X 100	ThermoFisher	807423
Trypsin	Hyclone Laboratories	SH30236.02	Cell Culture
Tween	Fisher Scientific	BP337
Universal compression Device	CellScale	UniVert
Von Kossa stain	Sigma-Aldrich	1.00362	Histology