Scaffold decellularizzati derivati da mele per l'ingegneria del tessuto osseo in vitro e in vivo

Summary

In questo studio, descriviamo in dettaglio i metodi di decellularizzazione, caratterizzazione fisica, imaging e impianto in vivo di biomateriali a base vegetale, nonché metodi per la semina e la differenziazione cellulare negli scaffold. I metodi descritti consentono la valutazione di biomateriali di origine vegetale per applicazioni di ingegneria del tessuto osseo.

Abstract

I biomateriali di cellulosa di origine vegetale sono stati impiegati in varie applicazioni di ingegneria tissutale. Studi in vivo hanno dimostrato la notevole biocompatibilità di scaffold realizzati in cellulosa derivata da fonti naturali. Inoltre, questi scaffold possiedono caratteristiche strutturali rilevanti per più tessuti e promuovono l’invasione e la proliferazione delle cellule dei mammiferi. Recenti ricerche che utilizzano tessuto di ipanzio di mela decellularizzato hanno dimostrato la somiglianza della dimensione dei suoi pori con quella dell’osso trabecolare, nonché la sua capacità di supportare efficacemente la differenziazione osteogenica. Il presente studio ha ulteriormente esaminato il potenziale degli scaffold di cellulosa derivati dalla mela per applicazioni di ingegneria del tessuto osseo (BTE) e ha valutato le loro proprietà meccaniche in vitro e in vivo . I preosteoblasti MC3T3-E1 sono stati seminati in scaffold di cellulosa derivati da mele che sono stati poi valutati per il loro potenziale osteogenico e le proprietà meccaniche. La colorazione con fosfatasi alcalina e rosso alizarina S ha confermato la differenziazione osteogenica in scaffold coltivati in terreno di differenziamento. L’esame istologico ha dimostrato un’invasione cellulare diffusa e una mineralizzazione attraverso gli scaffold. La microscopia elettronica a scansione (SEM) ha rivelato aggregati minerali sulla superficie degli scaffold e la spettroscopia a dispersione di energia (EDS) ha confermato la presenza di elementi fosfato e calcio. Tuttavia, nonostante un aumento significativo del modulo di Young in seguito alla differenziazione cellulare, è rimasto inferiore a quello del tessuto osseo sano. Studi in vivo hanno mostrato l’infiltrazione cellulare e la deposizione di matrice extracellulare all’interno degli scaffold derivati da mele decellularizzate dopo 8 settimane di impianto nella calvaria di ratto. Inoltre, la forza richiesta per rimuovere le impalcature dal difetto osseo era simile al carico di frattura precedentemente riportato dell’osso calvario nativo. Nel complesso, questo studio conferma che la cellulosa derivata dalla mela è un candidato promettente per le applicazioni BTE. Tuttavia, la dissomiglianza tra le sue proprietà meccaniche e quelle del tessuto osseo sano può limitarne l’applicazione a scenari a basso carico. Potrebbero essere necessarie ulteriori reingegnerizzazioni e ottimizzazioni strutturali per migliorare le proprietà meccaniche degli scaffold in cellulosa derivati dal melo per applicazioni portanti.

Introduction

I difetti ossei di grandi dimensioni causati da una lesione o da una malattia spesso richiedono innesti di biomateriali per una rigenerazione completa¹. Le attuali tecniche progettate per migliorare la rigenerazione del tessuto osseo utilizzano regolarmente innesti autologhi, allogenici, xenogenici o sintetici². Per l’innesto osseo autologo, considerato la pratica di innesto “gold standard” per riparare grandi difetti ossei, l’osso viene estratto dal paziente. Tuttavia, questa procedura di innesto presenta diversi inconvenienti, tra cui limitazioni di dimensioni e forma, disponibilità di tessuti e morbilità del sito di campionamento³. Inoltre, le procedure di innesto autologo sono suscettibili di infezioni del sito chirurgico, conseguenti fratture, formazione di ematomi nel sito di prelievo o ricostruito e dolore post-operatorio⁴. L’ingegneria del tessuto osseo (BTE) offre una potenziale alternativa ai metodi convenzionali di innesto osseo⁵. Combina biomateriali strutturali e cellule per costruire nuovo tessuto osseo funzionale. Quando si progettano biomateriali per la BTE, è fondamentale combinare una struttura macroporosa, una chimica superficiale che promuova l’adesione cellulare e proprietà meccaniche che assomiglino molto a quelle dell’osso nativo⁶. Ricerche precedenti hanno indicato che la dimensione dei pori e il modulo elastico ideali per i biomateriali utilizzati nella BTE sono rispettivamente di circa 100-200 μm⁷ e 0,1-20 GPa, a seconda del sito di innesto⁸. Inoltre, la porosità e l’interconnessione dei pori degli scaffold sono fattori critici che influenzano la migrazione cellulare, la diffusione dei nutrienti e l’angiogenesi⁸.

La BTE ha mostrato risultati promettenti con vari biomateriali sviluppati e valutati come opzioni alternative agli innesti ossei. Alcuni di questi biomateriali sono materiali osteoinduttivi, materiali ibridi e idrogel avanzati⁸. I materiali osteoinduttivi stimolano lo sviluppo di strutture ossee di nuova formazione. I materiali ibridi sono composti da polimeri sintetici e/o naturali⁸. Gli idrogel avanzati imitano la matrice extracellulare (ECM) e sono in grado di fornire i fattori bioattivi necessari per promuovere l’integrazione del tessuto osseo⁸. L’idrossiapatite è un materiale tradizionale e una scelta comune per la BTE grazie alla sua composizione e biocompatibilità⁹. Il vetro bioattivo è un altro tipo di biomateriale per la BTE, che ha dimostrato di stimolare specifiche risposte cellulari per attivare i geni necessari per l’osteogenesi^10,11. Anche i polimeri biodegradabili, tra cui il poli(acido glicolico) e il poli(acido lattico), sono stati ampiamente utilizzati nelle applicazioni BTE¹². Infine, anche i polimeri naturali o di derivazione naturale come il chitosano, la chitina e la cellulosa batterica hanno dimostrato risultati incoraggianti per la BTE¹³. Tuttavia, mentre sia i polimeri sintetici che quelli naturali mostrano un potenziale per la BTE, lo sviluppo di un’impalcatura funzionale con la macrostruttura desiderata richiede in genere protocolli estesi.

Al contrario, le strutture macroscopiche native della cellulosa possono essere facilmente derivate da diverse piante e il nostro gruppo di ricerca ha precedentemente dimostrato l’applicabilità di scaffold a base di cellulosa derivati da piante a diverse ricostruzioni tissutali. Infatti, a seguito di un semplice trattamento con tensioattivi, abbiamo sfruttato la struttura intrinseca del materiale vegetale, evidenziandone il potenziale come biomateriale versatile¹⁴. Inoltre, questi scaffold a base di cellulosa possono essere utilizzati per applicazioni di coltura cellulare di mammifero in vitro ¹⁴, sono biocompatibili e supportano la vascolarizzazione sottocutanea spontanea 14,15,16,17. Sia il nostro gruppo di ricerca che altri hanno dimostrato che questi scaffold possono essere ottenuti da piante specifiche in base all’applicazione prevista 14,15,16,17,18,19,20. Ad esempio, la struttura vascolare osservata negli steli e nelle foglie delle piante mostra una sorprendente somiglianza con la struttura che si trova nei tessuti animali¹⁹. Inoltre, gli scaffold di cellulosa derivati dalle piante possono essere facilmente modellati e sottoposti a modifiche biochimiche superficiali per ottenere le caratteristiche desiderate¹⁶. In uno studio recente, abbiamo incorporato un tampone salino durante il processo di decellularizzazione, portando a un maggiore attaccamento cellulare osservato sia in vitro che in vivo ¹⁶. Nello stesso studio, abbiamo dimostrato l’applicabilità degli scaffold di cellulosa di origine vegetale nei biomateriali compositi mediante colata di idrogel sulla superficie degli scaffold. In studi recenti, la funzionalizzazione di scaffold di origine vegetale ha dimostrato di migliorarne l’efficacia¹⁸. Ad esempio, uno studio condotto da Fontana et al. (2017) ha rivelato che l’adesione dei fibroblasti dermici umani era supportata da steli decellularizzati rivestiti di RGD, mentre gli steli non rivestiti non mostravano la stessa capacità¹⁸. Inoltre, gli autori hanno anche dimostrato che il fluido corporeo simulato modificato potrebbe essere utilizzato per mineralizzare artificialmente gli steli delle piante decellularizzate. In studi più recenti, abbiamo esplorato il concetto di osteogenesi meccanosensibile negli scaffold di cellulosa di origine vegetale e valutato il loro potenziale per BTE^17,20. Inoltre, Lee et al. (2019) hanno utilizzato scaffold di origine vegetale per coltivare tessuti simili alle ossa in un ambiente in vitro ²¹. Attraverso valutazioni complete di diverse fonti vegetali, gli autori hanno identificato gli scaffold derivati dalla mela come i più ottimali per la coltura e la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC). Inoltre, gli autori hanno proposto che gli attributi strutturali e meccanici degli scaffold derivati dalle mele svolgano un ruolo fondamentale nella loro idoneità allo scopo previsto. Essendo i primi scaffold di origine vegetale implementati nelle applicazioni di ingegneria tissutale, gli scaffold derivati dal melo hanno ampiamente dimostrato di possedere un’architettura sorprendentemente simile a quella dell’osso umano, in particolare in termini di pori interconnessi che vanno da 100 a 200 μm di diametro^14,21.

Nel presente studio, abbiamo ulteriormente studiato il potenziale degli scaffold di cellulosa derivati dalla mela per la BTE e condotto un’analisi delle loro proprietà meccaniche sia in vitro che in vivo. Sebbene ci siano stati studi sul potenziale degli scaffold derivati dalla mela per BTE 17,20,21, le loro proprietà meccaniche sono state poco studiate. I risultati hanno mostrato un’invasione selvaggia e una differenziazione osteogenica dei preosteoblasti MC3T3-E1 seminati in scaffold che sono stati coltivati in terreno di differenziazione per 4 settimane. Il modulo di Young di questi scaffold era di 192,0 ± 16,6 kPa, che era significativamente superiore a quelli degli scaffold vuoti (scaffold senza cellule seminate) (31,6 ± 4,8 kPa) e degli scaffold seminati in cellula coltivati in terreno di non-differenziazione (24,1 ± 8,8 kPa). Tuttavia, va notato che il modulo di Young del tessuto osseo umano sano rientra tipicamente nell’intervallo di 0,1-2 GPa per l’osso trabecolare e di circa 15-20 GPa per l’osso corticale⁸. Tuttavia, a seguito di un impianto di 8 settimane in un difetto calvario del roditore, gli scaffold seminati dalle cellule sembravano essere ben integrati nell’osso circostante, come dimostrato da una forza di picco media di 113,6 N ± 18,2 N nei test di push-out, che è simile al carico di frattura precedentemente riportato dell’osso calvario nativo²². Nel complesso, i risultati ottenuti da questo studio sono molto promettenti, in particolare per le applicazioni non portanti. Tuttavia, gli scaffold di cellulosa derivati dalla mela non possiedono attualmente le proprietà meccaniche necessarie per abbinare con precisione il tessuto osseo circostante in un sito implantare. Di conseguenza, è necessario un ulteriore sviluppo per sbloccare il pieno potenziale di questi scaffold.

Protocol

I protocolli sperimentali sono stati esaminati e approvati dal Comitato per la cura degli animali dell’Università di Ottawa. 1. Preparazione dell’impalcatura Usa un’affettatrice a mandolina per tagliare le mele McIntosh (Canada Fancy) a fette spesse 8 mm. Tagliare il tessuto di ipanzio delle fette di mela in quadrati di 5 mm x 5 mm. Mettere i campioni quadrati in sodio dodecilsolfato (SDS) allo 0,1% per 2 giorni. Lavare i campioni decellularizzat…

Representative Results

Misurazione delle dimensioni dei pori, distribuzione cellulare e mineralizzazione in vitro (Figura 1 e Figura 2)La rimozione completa dei componenti cellulari nativi degli scaffold tissutali della mela è stata ottenuta dopo aver trattato gli scaffold con SDS e CaCl2 (Figura 1A). Le impalcature mostravano una struttura altamente porosa, che è stata confermata utilizzando la microscopia confo…

Discussion

Diversi studi in vitro e in vivo hanno dimostrato la biocompatibilità della cellulosa di origine vegetale e il suo potenziale utilizzo nell’ingegneria tissutale 14,15,16,18,19,20, più specificamente per ospitare la differenziazione osteogenica^{20,21</sup…}

Materials

4′,6-diamidino-2-phenylindole	ThermoFisher	D1306	DAPI
5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate and nitro-blue tetrazolium	Sigma-Aldrich	B5655	BCIP/NBT
Alizarin red S	Sigma-Aldrich	A5533	ARS
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4403	Cell Culture
Calcium Chloride	ThermoFisher	AA12316	CaCl2
Calcofluor White	Sigma-Aldrich	18909
Dental drill			Surgical tool
Ethanol	ThermoFisher	615095000
Fetal bovine serum	Hyclone Laboratories	SH30396	FBS
Formalin	Sigma-Aldrich	HT501128	10% Formalin
Goldner's trichrome stain	Sigma-Aldrich	1.00485	GTC
Hematoxylin and eosin stain	Fisher Scientific	NC1470670	H&E
High-speed resonant confocal laser scanning microscope	Nikon	Nikon Ti-E A1-R
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
ImageJ software	National Institutes of Health
Irrigation saline	Baxter	JF7123	0.9% NaCl
MC3T3-E1 Subclone 4 cells	ATCC	CRL-2593	Pre-osteoblast cells
McIntosh apples			Canada Fancy grade
Methyl methacrylate	Sigma-Aldrich	M55909	Histological embedding
Minimum Essential Medium	ThermoFisher	M0894	α-MEM
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	O4042	4%; PFA
Penicillin/Streptomycin	Hyclone Laboratories	SV30010	Cell Culture
Periodic acid	Sigma-Aldrich	375810
Phosphate buffered saline	Hyclone Laboratories	2810305	PBS; without Ca2+ and Mg2+
Propidium iodide	Invitrogen	p3566
Scanning electron microscope	JEOL	JSM-7500F FESEM	SEM and EDS
Slide scanner microscope	Zeiss	AXIOVERT 40 CFL
Sodium dodecyl sulfate	Fisher Scientific	BP166	SDS
Sodium metabisulphite	Sigma-Aldrich	31448
Sodium phosphate	ThermoFisher	BP329
Sprague-Dawley rats	Charles-River Laboratories	400	Male
Sutures	Ethicon	J494G	4-0
Trephine	ACE Surgical Supply Co	583-0182	5-mm diameter
Triton-X 100	ThermoFisher	807423
Trypsin	Hyclone Laboratories	SH30236.02	Cell Culture
Tween	Fisher Scientific	BP337
Universal compression Device	CellScale	UniVert
Von Kossa stain	Sigma-Aldrich	1.00362	Histology