Oprichting van van alvleesklierkanker afgeleide tumororganoïden en fibroblasten uit vers weefsel
Summary
Tumororganoïden hebben een revolutie teweeggebracht in kankeronderzoek en de benadering van gepersonaliseerde geneeskunde. Ze vertegenwoordigen een klinisch relevant tumormodel waarmee onderzoekers de tumor in de kliniek een stap voor kunnen blijven. Dit protocol stelt tumororganoïden vast uit verse weefselmonsters van pancreastumoren en van patiënten afgeleide xenotransplantaten van pancreasadenocarcinoomoorsprong.
Abstract
Tumororganoïden zijn driedimensionale (3D) ex vivo tumormodellen die de biologische belangrijkste kenmerken van de oorspronkelijke primaire tumorweefsels samenvatten. Patiënt-afgeleide tumororganoïden zijn gebruikt in translationeel kankeronderzoek en kunnen worden toegepast om de gevoeligheid en resistentie van de behandeling, cel-celinteracties en tumorcelinteracties met de tumormicro-omgeving te beoordelen. Tumororganoïden zijn complexe kweeksystemen die geavanceerde celkweektechnieken en kweekmedia vereisen met specifieke groeifactorcocktails en een biologisch basaalmembraan dat de extracellulaire omgeving nabootst. Het vermogen om primaire tumorculturen tot stand te brengen hangt sterk af van het weefsel van oorsprong, de cellulariteit en de klinische kenmerken van de tumor, zoals de tumorgraad. Bovendien zijn het verzamelen van weefselmonsters, de kwaliteit en kwantiteit van het materiaal, evenals de juiste biobank en -opslag cruciale elementen van deze procedure. De technische mogelijkheden van het laboratorium zijn ook cruciale factoren om rekening mee te houden. Hier rapporteren we een gevalideerd SOP/protocol dat technisch en economisch haalbaar is voor de kweek van ex vivo tumororganoïden uit verse weefselmonsters van pancreasadenocarcinoomoorsprong, hetzij van vers primair gereseceerd donorweefsel van de patiënt of van de patiënt afgeleide xenotransplantaten (PDX). De hierin beschreven techniek kan worden uitgevoerd in laboratoria met basisweefselkweek- en muisfaciliteiten en is op maat gemaakt voor brede toepassing op het gebied van translationele oncologie.
Introduction
Tumororganoïden zijn ex vivo driedimensionale (3D) georganiseerde culturen die zijn afgeleid van vers tumorweefsel en kankermodellen opleveren. Tumororganoïden recapituleren de biologische belangrijkste kenmerken van de oorspronkelijke primaire tumor 1,2,3,4 en kunnen tot enkele maanden worden uitgebreid en gecryopreserveerd, vergelijkbaar met conventionele onsterfelijke cellijnen. Tumororganoïden bieden een biobank van patiënt-afgeleide tumormodellen voor translationele/gepersonaliseerde geneeskunde5 en vertegenwoordigen een belangrijke vooruitgang in kankercelbiologische systemen/modellen. Patiënt-afgeleide tumororganoïden kunnen worden gebruikt als ex vivo modellen om de werkzaamheid te voorspellen van (neo)adjuvante oncologische/farmacologische therapieën, waarvoor culturen worden gemaakt van vers tumorweefsel en geneesmiddelgevoeligheidstesten of farmacotypering worden uitgevoerd op patiëntspecifieke basis om effectieve middelen te identificeren voor volgende therapielijnen 1,4. Bovendien overwinnen tumororganoïden de beperking van de beschikbaarheid van primair tumorweefsel en, nog belangrijker, bieden ze een uitstekend alternatief of complementair systeem voor in vivo muismodellen, zoals van patiënten afgeleide xenotransplantaten (PDX)2. De complexiteit van tumororganoïden neemt toe als de primaire tumorcellen worden gecombineerd met stromale cellen die worden aangetroffen in de tumormicro-omgeving (TME), zoals kankergeassocieerde fibroblasten (CAF’s), endotheelcellen en immuuncellen, die de werking en complexe cellulariteit van de primaire tumor nabootsen. Tumororganoïden zijn vastgesteld voor veel tumortypes met behulp van gestandaardiseerde protocollen 6,7,8,9,10. Organoïde-voortplanting van verschillende solide tumoren, waaronder colorectaal en borstkankerweefsel, is goed ingeburgerd en technisch betaalbaar 11,12,13,14,15.
Chirurgische tumorresecties of tumorbiopten leveren primaire tumorweefselmonsters op. Idealiter zouden tumorweefselmonsters uit het midden van de tumormassa of de binnenvallende rand van de tumor moeten komen, evenals normaal ogend weefsel naast de tumor. In vergelijking met conventionele 2D-culturen hebben tumororganoïden verschillende “add-ons” nodig, waaronder een biologisch basaalmembraan (zoals Matrigel, hydrogel of een op collageen gebaseerde steiger), die de extracellulaire TME nabootst, en een vloeibaar groeimedium dat specifieke voedingsstoffen en groeifactoren levert en de celproliferatie en levensvatbaarheid in cultuur ondersteunt.
De meest elementaire stappen in de primaire celkweek zijn het wassen van het weefsel in een zoutoplossing om besmetting te voorkomen, het mechanisch snijden/verteren van de tumor in kleine stukjes van 1-3mm3 en de behandeling met collagenase voor de enzymatische vertering van het weefsel. Het verteerde mengsel wordt vervolgens gefilterd om grote weefselfragmenten te verwijderen, geresuspendeerd in een biologisch basaalmembraan zoals Matrigel, en geplateerd als koepels in kweekplaten met lage hechting om de groei van niet-gehechtheid te bevorderen. De koepels van de basale membraanmatrix zijn bedekt met vloeibaar kweekmedium en aangevuld met glutamine en antibiotica om besmetting te voorkomen, evenals met specifieke groeifactoren, afhankelijk van het weefseltype 7,8,9,16,17. Andere relevante cellen die aanwezig zijn in de bulktumor en de TME kunnen ook worden geïsoleerd, zoals kankergeassocieerde fibroblasten (CAF’s) en immuuncellen. Deze techniek, die onlangs is herzien18, maakt het mogelijk om co-culturen met verschillende celtypen tot stand te brengen om de respons op therapie te bestuderen in een meer “realistische” tumoromgeving. Verder kunnen cel-cel interacties en de interactie tussen tumorcellen en componenten van de omringende biologische matrix bestudeerd worden.
Het gerapporteerde slagingspercentage van het vaststellen van tumororganoïden met behulp van vers weefsel uit biopsieën of gereseceerd gastro-intestinaal tumorweefsel is ongeveer 50%11, en het slagingspercentage van het laatste is grotendeels afhankelijk van het weefseltype ende oorsprong 4, met name de tumorgraad en de algehele cellulariteit van de tumor. Driedimensionale tumormodellen hebben verschillende complexiteit, van eenvoudige eencellige aggregaten tot zeer complexe gemanipuleerde modellen bestaande uit verschillende celtypen. De terminologie die in de literatuur wordt gebruikt om 3D-culturen te beschrijven is zeer inconsistent 19,20,21, aangezien verschillende termen zoals sferoïden, tumorsferen en organoïden worden gebruikt, hoewel het verschil tussen beide onduidelijk is. Omdat er nog geen duidelijke consensus over de definitie is bereikt, wordt in dit artikel een tumororganoïde beschreven als een georganiseerde tumorcelcultuur ingebed in een biologisch basaalmembraan.
Hierin wordt een gevalideerd protocol gerapporteerd voor het vaststellen van tumororganoïden uit verse weefselmonsters die afkomstig zijn van vers primair gereseceerd of PDX-afgeleid ductaal adenocarcinoom van de pancreas (PDAC), en dit protocol kan worden uitgevoerd in de meeste laboratoria met basisweefselkweekfaciliteiten. Dit protocol is aangepast van verschillende state-of-the-art gerapporteerde protocollen die momenteel worden gebruikt om tumororganoïden of tumoroïden vast te stellen uit spijsverteringstumorweefsel uit de groepen van David Tuveson9, Hans Clevers8 en Aurel Perren7.
Dit protocol bespreekt niet hoe het verse weefsel wordt geoogst. Om vers menselijk tumorweefsel van hoge kwaliteit te verkrijgen, is het belangrijk om een efficiënte coördinatie te hebben tussen de chirurgen die het weefsel oogsten en de pathologieafdeling die het weefselmonster extraheert voor organoïdekweek. Evenzo is bij het gebruik van PDX als bron van vers weefsel ook een efficiënte coördinatie met de persoon die het weefselmonster oogst belangrijk. Het is van cruciaal belang om het weefselmonster zo snel mogelijk te verkrijgen (binnen 30-60 minuten na het oogsten) om een hoge kwaliteit te behouden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Grote vooruitgang in farmacologische kankertherapieën is een uitdaging, aangezien de kans op goedkeuring van geneesmiddelen in fase I klinische onderzoeken naar oncologie 5,1% is, wat het laagste is van alle ziektetypes. De belangrijkste reden is dat kanker zeer heterogeen is en daarom reageren patiëntencohorten niet uniform zoals verwacht op de gegeven behandeling, wat benadrukt dat een meer gepersonaliseerde aanpak nodig is. Tweedimensionale (2D) culturen worden al vele jaren gebruikt in trans…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door financiering van de Plataforma biobancos y biomodelos – Unidades de las Plataformas ISCIII de apoyo ala I+D+i en Biomedicina y Ciencias de la Salud (PT20/00045), het Horizon 2020-onderzoeks- en innovatieprogramma van de Europese Unie in het kader van subsidieovereenkomst nr. 857381, project VISION (Strategieën ter versterking van wetenschappelijke excellentie en innovatiecapaciteit voor vroege diagnose van gastro-intestinale kankers), Intramurale oproep voor nieuwe onderzoeksprojecten voor klinische onderzoekers en opkomende onderzoeksgroepen IRYCIS (2021/0446), Patient Derived Organoids 2.0 Project (CIBERONC) en het TRANSCAN II-project JTC 2017 call “Establishing an algorithm for the early diagnosis and follow-up of patients with pancreas neuro-endocrine tumors (NExT)”, subsidienummer 1.1.1.5/ERANET/20/03. De biologische monsters die in dit protocol worden gebruikt, zijn geleverd door het BioBank Hospital Ramón y Cajal-IRYCIS (B.0000678) en geïntegreerd in het platform voor biobanken en biomodellen van de ISCIII (PT20/00045). We willen ook Yvonne Kohl, Agapi Kataki Vita Rovita en Thorsten Knoll bedanken voor hun onschatbare steun bij het ontwikkelen van dit protocol als onderdeel van de NExT- en VISION-projecten.
Materials
| 6 well Costar Ultra-low Attachment plates | Biofil | TCP011006 | |
| 70 μm pore strainer | VWR | 732-2758 | |
| Ammonium Chloride Potassium (ACK) Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290018 | |
| Cell culture incubator (21% O2, 5% CO2 and 37 ºC) | Nuaire | NU-4750E | |
| Cell recovery solution | Corning | 354253 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104019 | |
| DMEM/F-12 (1:1)(1X) with L-Glutamine and HEPES | Gibco | 31330-038 | |
| DNase | Roche | 10104159001 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-079-CV | |
| Freezing container, Nalgene | Merck | C1562 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Milteny Biotec | 130-096-427 | |
| HEPES | Gibco | 15630056 | |
| Human Placenta Growth Factor (PlGF) | enQuireBio | QP6485-EC-100UG | |
| Immunocompromised female 6-week-old NU-Foxn1nu nude mice | Janvier, France | ||
| Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) | Invitrogen | RP10931 | |
| L-Glutamine | Corning | 354235 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 356234 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
| Pasteur pipettes | Deltalab | 200007 | |
| Penicillin Streptomycin Solution (100x) | Corning | 30-002-CI | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Gibco | PHG0026 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Gibco | PHG0311 | |
| ROCK Inhibitor Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL | 72304 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | |
| Surgical Blades | Nahita | FMB018 | |
| Trypsin | Gibco | 25300054 |
Referências
- April-Monn, S. L., et al. Patient-derived tumoroids of advanced high-grade neuroendocrine neoplasms mimic patient chemotherapy responses and guide the design of personalized combination therapies. bioRxiv. , (2022).
- Frappart, P. O., et al. Pancreatic cancer-derived organoids – A disease modeling tool to predict drug response. United European Gastroenterology Journal. 8 (5), 594-606 (2020).
- Tiriac, H., et al. Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
- Aberle, M. R., et al. Patient-derived organoid models help define personalized management of gastrointestinal cancer. The British Journal of Surgery. 105 (2), e48-e60 (2018).
- Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 4 (2020).
- Hong, H. K., et al. Efficient primary culture model of patient-derived tumor cells from colorectal cancer using a Rho-associated protein kinase inhibitor and feeder cells. Oncology Reports. 42 (5), 2029-2038 (2019).
- April-Monn, S. L., et al. 3D primary cell culture: A novel preclinical model for pancreatic neuroendocrine tumors (PanNETs). Neuroendocrinology. 111 (3), 273-287 (2020).
- Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), e106 (2020).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 5739 (2020).
- Yu, J., Huang, W. The progress and clinical application of breast cancer organoids. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 295 (2020).
- Barbáchano, A., et al. Organoids and colorectal cancer. Cancers. 13 (11), 2657 (2021).
- Michels, B. E., et al. Human colon organoids reveal distinct physiologic and oncogenic Wnt responses. Journal of Experimental Medicine. 216 (3), 704-720 (2019).
- Van De Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Porter, R. J., Murray, G. I., McLean, M. H. Current concepts in tumour-derived organoids. British Journal of Cancer. 123 (8), 1209-1218 (2020).
- Wang, Q., Guo, F., Jin, Y., Ma, Y. Applications of human organoids in the personalized treatment for digestive diseases. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 336 (2022).
- Wang, J., et al. Patient-derived tumor organoids: New progress and opportunities to facilitate precision cancer immunotherapy. Frontiers in Oncology. 12, 1382 (2022).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Marsee, A., et al. Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids. Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).
- Mueller, M. T., et al. Combined targeted treatment to eliminate tumorigenic cancer stem cells in human pancreatic cancer. Gastroenterology. 137 (3), 1102-1113 (2009).
- Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 20 (2), 273-286 (2019).
- Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).
- Chen, P., et al. Patient-derived organoids can guide personalized-therapies for patients with advanced breast cancer. Advanced Science. 8 (22), 2101176 (2021).
- Furbo, S., et al. Use of patient-derived organoids as a treatment selection model for colorectal cancer: A narrative review. Cancers. 14 (4), 1069 (2022).
- Xu, H., Jiao, D., Liu, A., Wu, K. Tumor organoids: Applications in cancer modeling and potentials in precision medicine. Journal of Hematology & Oncology. 15 (1), 58 (2022).
- Xu, H., et al. Organoid technology in disease modelling, drug development, personalized treatment and regeneration medicine. Experimental Hematology & Oncology. 7 (1), 30 (2018).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Ling, L., et al. Effect of heparin on the biological properties and molecular signature of human mesenchymal stem cells. Gene. 576, 292-303 (2016).
- Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 818-827 (2008).
- Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs. Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).
- Walsh, A. J., et al. Drug response in organoids generated from frozen primary tumor tissues. Scientific Reports. 6, 18889 (2016).
- Bui, B. N., et al. Organoids can be established reliably from cryopreserved biopsy catheter-derived endometrial tissue of infertile women. Reproductive BioMedicine Online. 41 (3), 465-473 (2020).
- Verissimo, C. S., et al. Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening. eLife. 5, e18489 (2016).
- Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
- Protocols for Generating, Manipulating, and Analyzing Pancreatic Organoid Cultures. Cold Spring Harbor Laboratory. Tuveson Lab Available from: https://tuvesonlab.labsites.cshl.edu/protocolsreagents/ (2023)
