Mise en place d’organoïdes tumoraux et de fibroblastes dérivés du cancer du pancréas à partir de tissus frais
Summary
Les organoïdes tumoraux ont révolutionné la recherche sur le cancer et l’approche de la médecine personnalisée. Ils représentent un modèle de tumeur cliniquement pertinent qui permet aux chercheurs de garder une longueur d’avance sur la tumeur en clinique. Ce protocole établit des organoïdes tumoraux à partir d’échantillons frais de tissus tumoraux pancréatiques et de xénogreffes dérivées de patients d’origine adénocarcinome pancréatique.
Abstract
Les organoïdes tumoraux sont des modèles tumoraux ex vivo tridimensionnels (3D) qui récapitulent les principales caractéristiques biologiques des tissus tumoraux primaires d’origine. Les organoïdes tumoraux dérivés de patients ont été utilisés dans la recherche translationnelle sur le cancer et peuvent être appliqués pour évaluer la sensibilité et la résistance au traitement, les interactions cellule-cellule et les interactions des cellules tumorales avec le microenvironnement tumoral. Les organoïdes tumoraux sont des systèmes de culture complexes qui nécessitent des techniques de culture cellulaire avancées et des milieux de culture avec des cocktails de facteurs de croissance spécifiques et une membrane basale biologique qui imite l’environnement extracellulaire. La capacité d’établir des cultures tumorales primaires dépend fortement du tissu d’origine, de la cellularité et des caractéristiques cliniques de la tumeur, telles que le grade de la tumeur. De plus, la collecte d’échantillons de tissus, la qualité et la quantité des matériaux, ainsi qu’une biobanque et un stockage corrects sont des éléments cruciaux de cette procédure. Les capacités techniques du laboratoire sont également des facteurs cruciaux à prendre en compte. Ici, nous rapportons une SOP/protocole validé qui est techniquement et économiquement réalisable pour la culture d’organoïdes tumoraux ex vivo à partir d’échantillons de tissus frais d’origine adénocarcinome pancréatique, soit à partir de tissus de donneurs primaires primaires frais réséqués de patients, soit de xénogreffes dérivées de patients (PDX). La technique décrite ici peut être réalisée dans des laboratoires avec des installations de culture tissulaire et de souris de base et est adaptée à une large application dans le domaine de l’oncologie translationnelle.
Introduction
Les organoïdes tumoraux sont des cultures organisées en trois dimensions (3D) ex vivo qui sont dérivées de tissus tumoraux frais et fournissent des modèles de cancer. Les organoïdes tumoraux récapitulent les principales caractéristiques biologiques de la tumeur primaire d’origine 1,2,3,4 et peuvent être étendus jusqu’à plusieurs mois et cryoconservés, comme les lignées cellulaires immortalisées conventionnelles. Les organoïdes tumoraux fournissent une biobanque de modèles tumoraux dérivés de patients pour la médecine translationnelle/personnalisée5 et représentent une avancée importante dans les systèmes/modèles de biologie des cellules cancéreuses. Les organoïdes tumoraux dérivés du patient peuvent être utilisés comme modèles ex vivo pour prédire l’efficacité des thérapies oncologiques/pharmacologiques (néo)adjuvantes, pour lesquelles des cultures sont établies à partir de tissus tumoraux frais et des tests de sensibilité aux médicaments ou des pharmacotypages sont effectués sur une base spécifique au patient afin d’identifier des agents efficaces pour les lignes de traitement ultérieures 1,4. De plus, les organoïdes tumoraux surmontent la limitation de la disponibilité du tissu tumoral primaire et, plus important encore, fournissent un excellent système alternatif ou complémentaire aux modèles murins in vivo, tels que les xénogreffes dérivées du patient (PDX)2. La complexité des organoïdes tumoraux est augmentée si les cellules tumorales primaires sont combinées avec des cellules stromales qui se trouvent dans le microenvironnement tumoral (ETM), telles que les fibroblastes associés au cancer (CAF), les cellules endothéliales et les cellules immunitaires, qui imitent le fonctionnement et la cellularité complexe de la tumeur primaire. Des organoïdes tumoraux ont été établis pour de nombreux types de tumeurs à l’aide de protocoles standardisés 6,7,8,9,10. La propagation des organoïdes à partir de différentes tumeurs solides, y compris les tissus colorectaux et cancéreux du sein, est bien établie et techniquement abordable 11,12,13,14,15.
Les résections tumorales chirurgicales ou les biopsies tumorales fournissent des échantillons de tissus tumoraux primaires. Idéalement, les échantillons de tissu tumoral devraient provenir du centre de la masse tumorale ou du bord envahisseur de la tumeur, ainsi que des tissus d’apparence normale adjacents à la tumeur. Par rapport aux cultures 2D conventionnelles, les organoïdes tumoraux nécessitent plusieurs « add-ons », y compris une membrane basale biologique (telle que le Matrigel, l’hydrogel ou un échafaudage à base de collagène), qui imite l’ETM extracellulaire, et un milieu de croissance liquide qui fournit des nutriments et des facteurs de croissance spécifiques et soutient la prolifération et la viabilité cellulaires en culture16.
Les étapes les plus élémentaires de la culture cellulaire primaire sont le lavage du tissu dans une solution saline pour éviter la contamination, la découpe/digestion mécanique de la tumeur en petits morceaux de 1 à 3 mm3 et le traitement avec de la collagénase pour la digestion enzymatique du tissu. Le mélange digéré est ensuite filtré pour éliminer les gros fragments de tissus, remis en suspension dans une membrane basale biologique telle que Matrigel, et plaqué sous forme de dômes dans des plaques de culture à faible adhérence pour améliorer la croissance sans attachement. Les dômes de la matrice membranaire basale sont recouverts d’un milieu de culture liquide et complétés par de la glutamine et des antibiotiques pour éviter la contamination, ainsi que par des facteurs de croissance spécifiques en fonction du type de tissu 7,8,9,16,17. D’autres cellules pertinentes présentes dans la tumeur en vrac et l’ETM peuvent également être isolées, telles que les fibroblastes associés au cancer (CAF) et les cellules immunitaires. Cette technique, qui vient d’être revue18, permet la mise en place de co-cultures avec différents types de cellules pour étudier la réponse au traitement dans un environnement tumoral plus « réaliste ». De plus, les interactions cellule-cellule et l’interaction entre les cellules tumorales et les composants de la matrice biologique environnante peuvent être étudiées.
Le taux de réussite rapporté de l’établissement d’organoïdes tumoraux à l’aide de tissus frais provenant de biopsies ou de tissus tumoraux gastro-intestinaux réséqués est d’environ 50 %11, et le taux de réussite de ce dernier dépend largement du type et de l’origine des tissus4, en particulier du grade de la tumeur et de la cellularité tumorale globale. Les modèles de tumeurs tridimensionnels ont une complexité variable, allant de simples agrégats unicellulaires à des modèles techniques très complexes composés de différents types de cellules. La terminologie utilisée pour décrire les cultures 3D dans la littérature est très incohérente 19,20,21, car différents termes tels que sphéroïdes, tumorsphères et organoïdes sont utilisés, bien que la différence entre eux ne soit pas claire. Comme un consensus clair sur la définition n’a pas encore été atteint, dans cet article, un organoïde tumoral est décrit comme une culture de cellules tumorales organisée intégrée dans une membrane basale biologique.
Dans le présent document, un protocole validé est rapporté pour l’établissement d’organoïdes tumoraux à partir d’échantillons de tissus frais provenant d’adénocarcinomes canalaires pancréatiques (PDAC) primaires réséqués ou dérivés de PDX, et ce protocole peut être effectué dans la plupart des laboratoires disposant d’installations de culture tissulaire de base. Ce protocole a été adapté à partir de plusieurs protocoles de pointe qui sont actuellement utilisés pour établir des organoïdes tumoraux ou des tumoroïdes à partir de tissus tumoraux digestifs des groupes de David Tuveson9, Hans Clevers8 et Aurel Perren7.
Ce protocole ne traite pas de la façon dont les tissus frais sont récoltés. Pour obtenir du tissu tumoral humain frais de haute qualité, il est important d’avoir une coordination efficace entre les chirurgiens qui prélèvent le tissu et le service de pathologie qui extrait l’échantillon de tissu pour la culture organoïde. De même, lors de l’utilisation de PDX comme source de tissus frais, une coordination efficace avec la personne qui prélève l’échantillon de tissu est également importante. Il est essentiel d’obtenir l’échantillon de tissu le plus rapidement possible (dans les 30 à 60 minutes suivant le moment de la récolte) afin de maintenir une qualité élevée.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les progrès majeurs dans les thérapies pharmacologiques contre le cancer sont difficiles, car la probabilité d’approbation des médicaments dans les essais cliniques de phase I en oncologie est de 5,1 %, ce qui est le plus bas de tous les types de maladie23. La raison principale est que le cancer est très hétérogène et, par conséquent, les cohortes de patients ne répondent pas uniformément comme prévu au traitement donné, ce qui souligne qu’une approche plus personnalisée est néc…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par la Plataforma biobancos y biomodelos – Unidades de las Plataformas ISCIII de apoyo ala I+D+i en Biomedicina y Ciencias de la Salud (PT20/00045), le programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention n° 857381, le projet VISION (Stratégies visant à renforcer l’excellence scientifique et la capacité d’innovation pour le diagnostic précoce des cancers gastro-intestinaux), Appel intra-muros pour de nouveaux projets de recherche pour les chercheurs cliniciens et les groupes de recherche émergents IRYCIS (2021/0446), Patient Derived Organoids 2.0 Project (CIBERONC) et le projet TRANSCAN II JTC 2017 appel « Établissement d’un algorithme pour le diagnostic précoce et le suivi des patients atteints de tumeurs neuroendocrines pancréatiques (NExT) », numéro de subvention 1.1.1.5/ERANET/20/03. Les échantillons biologiques utilisés dans ce protocole ont été fournis par l’hôpital BioBank Ramón y Cajal-IRYCIS (B.0000678) et intégrés dans la plateforme Biobanques et biomodèles de l’ISCIII (PT20/00045). Nous tenons également à remercier Yvonne Kohl, Agapi Kataki Vita Rovita et Thorsten Knoll pour leur soutien inestimable dans le développement de ce protocole dans le cadre des projets NExT et VISION.
Materials
| 6 well Costar Ultra-low Attachment plates | Biofil | TCP011006 | |
| 70 μm pore strainer | VWR | 732-2758 | |
| Ammonium Chloride Potassium (ACK) Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290018 | |
| Cell culture incubator (21% O2, 5% CO2 and 37 ºC) | Nuaire | NU-4750E | |
| Cell recovery solution | Corning | 354253 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104019 | |
| DMEM/F-12 (1:1)(1X) with L-Glutamine and HEPES | Gibco | 31330-038 | |
| DNase | Roche | 10104159001 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-079-CV | |
| Freezing container, Nalgene | Merck | C1562 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Milteny Biotec | 130-096-427 | |
| HEPES | Gibco | 15630056 | |
| Human Placenta Growth Factor (PlGF) | enQuireBio | QP6485-EC-100UG | |
| Immunocompromised female 6-week-old NU-Foxn1nu nude mice | Janvier, France | ||
| Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) | Invitrogen | RP10931 | |
| L-Glutamine | Corning | 354235 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 356234 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
| Pasteur pipettes | Deltalab | 200007 | |
| Penicillin Streptomycin Solution (100x) | Corning | 30-002-CI | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Gibco | PHG0026 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Gibco | PHG0311 | |
| ROCK Inhibitor Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL | 72304 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | |
| Surgical Blades | Nahita | FMB018 | |
| Trypsin | Gibco | 25300054 |
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