Teknikken, der involverer fagocytose af svampekonidier ved makrofager, anvendes i vid udstrækning til undersøgelser, der evaluerer moduleringen af immunresponserne mod svampe. Formålet med dette manuskript er at præsentere en metode til evaluering af fagocytose og clearance evner af humant perifert blod mononukleare-afledte makrofager stimuleret med Trichoderma stromaticum conidier.
Makrofager repræsenterer en afgørende forsvarslinje og er ansvarlige for at forhindre vækst og kolonisering af patogener i forskellige væv. Conidial fagocytose er en nøgleproces, der muliggør undersøgelse af de cytoplasmatiske og molekylære begivenheder involveret i makrofagpatogeninteraktioner samt til bestemmelse af dødstidspunktet for internaliserede konidier. Teknikken, der involverer fagocytose af svampekonidier ved makrofager, anvendes i vid udstrækning til undersøgelser, der evaluerer moduleringen af immunresponserne mod svampe. Unddragelse af fagocytose og flugt af fagosomer er mekanismer for svampevirulens. Her rapporterer vi de metoder, der kan bruges til analyse af fagocytose, clearance og levedygtighed af T. stromaticum conidia, en svamp, der anvendes som biokontrol- og biogødningsmiddel og er i stand til at fremkalde humane infektioner. Protokollen består af 1) Trichoderma-kultur , 2) vask for at opnå konidier, 3) isolering af mononukleære celler i perifert blod (PBMC’er) ved anvendelse af polysaccharoseopløsningsmetoden og differentiering af PBMC’erne i makrofager, 4) en in vitro-fagocytosemetode ved anvendelse af runde glasdæksler og farvning og 5) et clearanceassay til vurdering af konidiernes levedygtighed efter fagocytose af konidier. Sammenfattende kan disse teknikker bruges til at måle svampeclearance effektivitet af makrofager.
Trichoderma-slægten (Order: Hypocreales, Family: Hypocreaceae) består af allestedsnærværende, saprofytiske svampe, der er parasitter af andre svampearter og er i stand til at producere en række kommercielt nyttige enzymer1. Disse svampearter anvendes til fremstilling af heterologe proteiner2, fremstilling af cellulose3, ethanol, øl, vin og papir4, i tekstilindustrien5, fødevareindustrien6 og i landbruget som biologiske bekæmpelsesmidler 7,8. Ud over den industrielle interesse for disse svampearter har det stigende antal infektioner hos mennesker givet nogle Trichoderma-arter status som opportunistiske patogener9.
Trichoderma spp. vokser hurtigt i kultur, med oprindeligt hvide og bomuldsagtige kolonier, der bliver grønlig gul til mørkegrøn10. De er tilpasset til at leve i en bred vifte af pH- og temperaturforhold, og de opportunistiske arter er i stand til at overleve ved fysiologisk pH og temperaturer og dermed kolonisere forskellige humane væv 11,12,13. Det er vigtigt, at stigningen i infektionshastigheden for Trichoderma spp. kan være forbundet med virulensfaktorer, og disse er ikke godt undersøgt. Derudover er undersøgelser, der fokuserer på at forstå immunresponset mod opportunistiske Trichoderma-arter, stadig sjældne.
Under en infektion, sammen med neutrofiler, repræsenterer makrofager forsvarslinjen, der er ansvarlig for fagocytose, og forhindrer således vækst og kolonisering af patogener i forskellige væv. Ved hjælp af mønstergenkendelsesreceptorer, såsom tolllignende receptorer og C-type lektinreceptorer, makrofager fagocytosesvampe og behandler dem til fagosomer, hvilket fremmer et åndedrætsudbrud, frigivelsen af proinflammatoriske cytokiner og ødelæggelsen af de fagocytoserede mikroorganismer14. Fagocytosemekanismen kan imidlertid påvirkes og undgås af forskellige mikrobielle strategier, såsom svampecellernes størrelse og form; tilstedeværelsen af kapsler, der forhindrer fagocytose; faldende antallet af fagocytose-inducerende receptorer; ombygning af strukturen af actinfibre i cytoplasmaet; hindrer dannelsen af pseudopodier; og fagosom- eller fagosomflugt efter fagocytoseprocessen14.
Mange patogener, herunder Cryptococcus neoformans, bruger makrofager som en niche til at overleve i værten, sprede og fremkalde infektion15. Phagocytose og clearance assay bruges til at evaluere immunresponset mod patogener og til at identificere de mikrobielle strategier, der anvendes til at undgå det medfødte immunsystem 15,16,17. Denne type teknik kan også bruges til at undersøge differentialkinetikken af fagocytose, forsinket fagosomforsuring og oxidativ burst, der resulterer i reduceret svampedræbning18.
Forskellige metoder kan bruges til at evaluere fagocytose, svampeoverlevelse og unddragelse af fagosommodningsprocessen. Disse omfatter fluorescensmikroskopi, som bruges til at observere fagocytose, den cellulære placering og molekylerne produceret under fagocytose19; flowcytometri, som giver kvantitative data om fagocytose og bruges til at evaluere de forskellige markører, der er involveret i processen 20,21; intravital mikroskopi, som bruges til at vurdere mikrobiel indfangning og fagosommodning22; antistofmedieret fagocytose, som anvendes til at vurdere specificiteten af fagocytoseprocessen for et patogen23; og andre 24,25,26,27.
Protokollen, der præsenteres her, anvender en almindelig, billig og direkte metode ved hjælp af et optisk mikroskop og pladevækstassay til vurdering af fagocytose og drab af svampekonidier. Denne protokol vil give læserne trinvise instruktioner til udførelse af fagocytose og clearance assay ved hjælp af humane perifere blod mononukleare-afledte makrofager udsat for T. stromaticum. PBMC’er blev brugt, fordi Trichoderma conidia anvendes som biokontrol mod phytopathogener og en biogødning til planteafgrøder over hele verden og har forårsaget flere humane infektioner, kaldet Trichodermosis. Derudover er der kun to tidligere værker, der fokuserer på interaktionen mellem Trichoderma conidia og det menneskelige immunsystem, hvor vi undersøgte neutrofiler28 og autofagi i makrofager29. Denne artikel viser først, hvordan fagocytosen af konidierne af T. stromaticum ved PBMC-afledte makrofager kan studeres, og derefter hvordan levedygtigheden af de opslugte konidier kan vurderes ved hjælp af enkle mikroskopibaserede teknikker. Denne protokol kan yderligere lette undersøgelser af makrofagassocieret immunrespons eller immunsystemmodulationsrelaterede mekanismer.
For flere svampepatogener, herunder Aspergillus fumigatus, Cryptococcus, Candida albicans og andre, er conidial eller gærfagocytose en nøgleproces, der muliggør undersøgelse af de cytoplasmatiske og molekylære begivenheder i makrofagpatogeninteraktioner såvel som til bestemmelse af dødstidspunktet for de internaliserede konidier 14,39,40. Phagocytose er nøgleprocessen i Trichoderma-værtsin…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af følgende brasilianske finansieringsinstitutioner: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) med tilskud RED0011/2012 og RED008/2014. U.R.S., J.O.C. og M.E.S.M. anerkender stipendiet fra henholdsvis Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) og FAPESB.
15 mL centrifuge tubes | Corning | CLS431470 | 15 mL centrifuge tubes, polypropylene, conical bottom with lid, individually sterile |
24-Well Flat Bottom Cell Culture Plate | Kasvi | K12-024 | Made of polystyrene with alphanumeric identification; The Cell Culture Plate is DNase, RNase and pyrogen-free and free of cytotoxic substances; Sterilized by gamma radiation; |
Cell culture CO2 incubator | Sanyo | 303082 | A CO2 incubator serves to create and control conditions similar to a human body, thus allowing the in vitro growth and proliferation of different cell types. |
Centrifuge Microtube (eppendorf type) 1.5 mL | Capp | 5101500 | Made from polypropylene, with a cap attached to the tube for opening and closing with just one hand. It has a polished interior against protein adhesion and for sample visibility, being free of DNase, RNase and Pyrogens |
Circular coverslip 15 mm | Olen | K5-0015 | Circular coverslips are used for microscopy techniques in cell culture. Made of super transparent translucent glass; with thickness of 0.13 mm |
Class II Type B2 (Total Exhaust) Biosafety Cabinets | Esco Lifesciences group | 2010274 | Airstream Class II Type B2 Biosafety Cabinets (AB2) provide product, operator and environmental protection and are suitable for work with trace amounts of toxic chemicals and agents assigned to biological safety levels I, II or III. In a Class II Type B2 cabinet, all inflow and downflow air is exhausted after HEPA/ULPA filtration to the external environment without recirculation across the work surface. |
Dextrose Potato Agar medium | Merck | 145 | Potato Dextrose Agar is used in the cultivation and enumeration of yeasts and fungi |
EDTA vacuum blood collection tube | FirstLab | FL5-1109L | EDTA is the recommended anticoagulant for hematology routines as it is the best anticoagulant for preserving cell morphology. |
Entellan | Merck | 1.07961 | Fixative agent; Entellan is a waterless mounting medium for permanent mounting for microscopy. |
Fetal Bovine Serum | Gibco | A2720801 | Fetal bovine serum (FBS) is a universal growth supplement of cell and tissue culture media. FBS is a natural cocktail of most of the factors required for cell attachment, growth, and proliferation, effective for most types of human and animal (including insect) cells. |
Flaticon | database of images | ||
Glycerol | Merck | 24900988 | The cryoprotectant agent glycerol is used for freezing cells and spores |
Histopaque-1077 | polysucrose solution | ||
Image J | Image analysis software | ||
Microscopy slides | Precision | 7105 | Slide for Microscopy 26 x 76 mm Matte Lapped Thickness 1.0 to 1.2 mm. Made of special optical glass and packaged with silk paper divider with high quality transparency free of imperfections |
Mini centrifuge | Prism | C1801 | The Prism Mini Centrifuge was designed to be extremely compact with an exceptionally small footprint. Includes 2 interchangeable quick-release rotors that spin up to 6000 rpm. An electronic brake provides quick deceleration and the self-opening lid allows easy access to the sample, reducing handling time. |
Neubauer chamber | Kasvi | K5-0011 | The Neubauer Counting Chamber is used for counting cells or other suspended particles. |
Panoptic fast | Laborclin | 620529 | Laborclin's panoptic fast c is a kit for quick staining in hematology |
Penicillin/Streptomycin Solution – 10,000U | LGC- Biotechnology | BR3011001 | antibiotic is used in order to avoid possible contamination by manipulation external to the laminar flow. |
Petri dish 90 x 15 mm Smooth | Cralplast | 18248 | Disposable Petri dish; Made of highly transparent polystyrene (PS); flat bottom; Smooth;Size: 90 x 15 mm. |
Phosphate buffered saline (PBS) | thermo fisher Scientific | 10010001 | PBS is a water-based saline solution with a simple formulation. It is isotonic and non-toxic to most cells. It includes sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock while maintaining the water balance of living cells. |
Pipette Pasteur 3 mL Sterile | Accumax | AP-3-B-S | STERILE ACCUMAX PASTEUR 3 ML PIPETTE with 3 mL capacity, made of transparent low-density polyethylene (LDPE) and individually sterile |
Refrigerated Centrifuge | Thermo Scientific | TS-HM16R | The Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R Refrigerated Centrifuge is a refrigerated centrifuge with the user-friendly control panel makes it easy to pre-set the speed, RCF value, running time, temperature, and running profile. The Megafuge 16R can reach maximum speeds of 15,200 RPM and maximum RCF of 25,830 x g. |
RPMI-1640 Medium | Merck | MFCD00217820 | HEPES Modification, with L-glutamine and 25 mM HEPES, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture |
The single channel micropipettes | Eppendorf | Z683809 | Single-channel micropipettes are used to accurately transfer and measure very small amounts of liquids. |
Tip for Micropipettor | Corning | 4894 | Capacity of 10 µL and 1,000 µL Autoclavable |
Triocular inverted microscope | LABOMED | VU-7125500 | It allows you to observe cells inside tubes and bottles, without having to open them, thus avoiding contamination problems. |