فحص جدوى الترايكوديرما ستروماتيكوم كونيديا داخل الدم المحيطي البشري الضامة المشتقة أحادية النواة

Summary

تستخدم التقنية التي تنطوي على البلعمة من conidia الفطرية بواسطة الضامة على نطاق واسع للدراسات التي تقيم تعديل الاستجابات المناعية ضد الفطريات. الغرض من هذه المخطوطة هو تقديم طريقة لتقييم البلعمة وقدرات إزالة البلاعم المشتقة من الدم المحيطي البشري أحادية النواة المحفزة باستخدام Trichoderma stromaticum conidia.

Abstract

تمثل البلاعم خط دفاع حاسم وهي مسؤولة عن منع نمو واستعمار مسببات الأمراض في الأنسجة المختلفة. البلعمة المخروطية هي عملية رئيسية تسمح بالتحقيق في الأحداث السيتوبلازمية والجزيئية التي تنطوي عليها تفاعلات البلاعم الممرضة ، وكذلك لتحديد وقت وفاة الكونيديا الداخلية. تستخدم التقنية التي تنطوي على البلعمة من conidia الفطرية بواسطة الضامة على نطاق واسع للدراسات التي تقيم تعديل الاستجابات المناعية ضد الفطريات. التهرب من البلعمة والهروب من البلعمة هي آليات الفوعة الفطرية. هنا ، نبلغ عن الطرق التي يمكن استخدامها لتحليل البلعمة ، وإزالة ، وصلاحية T. stromaticum conidia ، وهي الفطريات التي تستخدم كعامل مكافحة حيوية وسماد حيوي وقادرة على إحداث العدوى البشرية. يتكون البروتوكول من 1) ثقافة الترايكوديرما ، 2) الغسيل للحصول على كونيديا ، 3) عزل خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) باستخدام طريقة محلول polysucrose وتمايز PBMCs إلى بلاعم ، 4) طريقة البلعمة في المختبر باستخدام أغطية زجاجية مستديرة وتلوينها ، و 5) مقايسة إزالة لتقييم صلاحية الكونيديا بعد البلعمة الكونيديا. باختصار ، يمكن استخدام هذه التقنيات لقياس كفاءة إزالة الفطريات للبلاعم.

Introduction

يتكون جنس الترايكوديرما (الرتبة: Hypocreales ، العائلة: Hypocreaceae) من الفطريات الرمية في كل مكان وهي طفيليات من الأنواع الفطرية الأخرى وقادرة على إنتاج مجموعة من الإنزيمات المفيدة تجاريا¹. تستخدم هذه الأنواع الفطرية لإنتاج البروتينات غير المتجانسة² ، وإنتاج السليلوز³ ، والإيثانول ، والبيرة ، والنبيذ ، والورق⁴ ، في صناعة النسيج⁵ ، وصناعة الأغذية⁶ ، وفي الزراعة كعوامل مكافحة بيولوجية ^7,8. بالإضافة إلى الاهتمام الصناعي بهذه الأنواع الفطرية ، فإن العدد المتزايد من الإصابات في البشر قد أعطى بعض أنواع الترايكوديرما حالة مسببات الأمراض الانتهازية⁹.

Trichoderma spp. تنمو بسرعة في الثقافة ، مع مستعمرات بيضاء وقطنية في البداية تتحول إلى الأصفر المخضر إلى الأخضر^{الداكن 10}. يتم تكييفها للعيش في مجموعة واسعة من ظروف الأس الهيدروجيني ودرجة الحرارة ، والأنواع الانتهازية قادرة على البقاء على قيد الحياة في درجة الحموضة الفسيولوجية ودرجات الحرارة ، وبالتالي ، استعمار الأنسجة البشرية المختلفة^11،12،13. الأهم من ذلك ، أن ارتفاع معدل الإصابة ب Trichoderma spp. قد يترافق مع عوامل الفوعة ، وهذه لم تدرس جيدا. بالإضافة إلى ذلك ، لا تزال الدراسات التي تركز على فهم الاستجابة المناعية ضد أنواع الترايكوديرما الانتهازية نادرة.

أثناء العدوى ، إلى جانب العدلات ، تمثل البلاعم خط الدفاع المسؤول عن البلعمة ، وبالتالي تمنع نمو واستعمار مسببات الأمراض في الأنسجة المختلفة. باستخدام مستقبلات التعرف على الأنماط ، مثل المستقبلات الشبيهة ب Toll ومستقبلات الليكتين من النوع C ، تقوم البلاعم بالفطريات البلعمية ومعالجتها في جسيمات البلعمة ، وبالتالي تعزيز انفجار الجهاز التنفسي ، وإطلاق السيتوكينات المؤيدة للالتهابات ، وتدمير الكائنات الحية الدقيقة البلعمية¹⁴. ومع ذلك ، يمكن أن تتأثر آلية البلعمة وتتهرب منها الاستراتيجيات الميكروبية المختلفة ، مثل حجم وشكل الخلايا الفطرية. وجود كبسولات تعيق البلعمة. تقليل عدد المستقبلات التي تحفز البلعمة ؛ إعادة تشكيل بنية ألياف الأكتين في السيتوبلازم ؛ إعاقة تشكيل الكاذب. وهروب البلعمة أو البلعمة بعد عملية البلعمة¹⁴.

تستخدم العديد من مسببات الأمراض ، بما في ذلك Cryptococcus neoformans ، الضامة كمكان مناسب للبقاء على قيد الحياة في المضيف ، ونشر العدوى وتحريضها¹⁵. يستخدم اختبار البلعمة والإزالة لتقييم الاستجابة المناعية ضد مسببات الأمراض وتحديد الاستراتيجيات الميكروبية المستخدمة للتهرب من جهاز المناعة الفطري^15،16،17. يمكن أيضا استخدام هذا النوع من التقنية لفحص الحركية التفاضلية للبلعمة ، وتحمض البلعمة المتأخر ، والانفجار التأكسدي الذي يؤدي إلى تقليل قتل الفطريات¹⁸.

يمكن استخدام طرق مختلفة لتقييم البلعمة، وبقاء الفطريات، والتهرب من عملية نضوج الجسيمات. وتشمل هذه المجهر الفلوري ، والذي يستخدم لمراقبة البلعمة ، والموقع الخلوي ، والجزيئات المنتجة أثناء البلعمة¹⁹. قياس التدفق الخلوي ، الذي يوفر بيانات كمية عن البلعمة ويستخدم لتقييم العلامات المختلفة المشاركة في العملية^20,21 ؛ الفحص المجهري داخل الجسم ، والذي يستخدم لتقييم التقاط الميكروبات ونضج البلعمة²² ؛ البلعمة بوساطة الأجسام المضادة ، والتي تستخدم لتقييم خصوصية عملية البلعمة لمسببات الأمراض²³ ؛ وغيرها^{24،25،26،27}.

يستخدم البروتوكول المقدم هنا طريقة شائعة ومنخفضة التكلفة ومباشرة باستخدام المجهر الضوئي ومقايسة نمو الصفائح لتقييم البلعمة وقتل الكونيديا الفطرية. سيوفر هذا البروتوكول للقراء تعليمات خطوة بخطوة لإجراء فحص البلعمة والإزالة باستخدام الضامة المشتقة من الدم البشري أحادي النواة المعرضة ل T. stromaticum. تم استخدام PBMCs لأن Trichoderma conidia يتم تطبيقه كمكافحة حيوية ضد مسببات الأمراض النباتية والأسمدة الحيوية للمحاصيل النباتية في جميع أنحاء العالم وتسبب في العديد من الإصابات البشرية ، والتي تسمى داء المشعرات. إلى جانب ذلك ، لا يوجد سوى عملين سابقين يركزان على التفاعل بين Trichoderma conidia وجهاز المناعة البشري ، حيث قمنا بفحص العدلات²⁸ والالتهام الذاتي في الضامة²⁹. توضح هذه المقالة أولا كيف يمكن دراسة البلعمة في كونيديا T. stromaticum بواسطة البلاعم المشتقة من PBMC ، ثم كيف يمكن تقييم صلاحية الكونيديا المبتلعة باستخدام تقنيات بسيطة قائمة على الفحص المجهري. قد يسهل هذا البروتوكول بشكل أكبر التحقيقات في الاستجابة المناعية المرتبطة بالبلاعم أو الآليات المتعلقة بتعديل الجهاز المناعي.

Protocol

الاعتبارات الأخلاقية والموضوعات البشريةأجريت جميع التجارب على البشر الموصوفة في هذه الدراسة وفقا لإعلان هلسنكي والقوانين الفيدرالية البرازيلية ووافقت عليها لجنة الأخلاقيات بجامعة ولاية سانتا كروز (رمز تعريف المشروع: 550.382 / 2014). تم جمع الدم المحيطي البشري من مت?…

Representative Results

تستخدم التقنية التي تنطوي على البلعمة من conidia الفطرية بواسطة الضامة على نطاق واسع للدراسات التي تقيم تعديل الاستجابات المناعية ضد الفطريات. استخدمنا البلعمة من T. stromaticum conidia لتقييم صلاحية الكونيديا بعد البلعمة ، لأن التهرب من البلعمة وهروب البلعمة هي آليات الفوعة الفطرية. يجب على الب…

Discussion

بالنسبة للعديد من مسببات الأمراض الفطرية بما في ذلك Aspergillus fumigatus و Cryptococcus و Candida albicans وغيرها ، فإن البلعمة المخروطية أو الخميرة هي عملية رئيسية تسمح بالتحقيق في الأحداث السيتوبلازمية والجزيئية في تفاعلات البلاعم الممرضة ، وكذلك لتحديد وقت وفاة الكونيديا الداخلية^14…

Materials

15 mL centrifuge tubes	Corning	CLS431470	15 mL centrifuge tubes, polypropylene, conical bottom with lid, individually sterile
24-Well Flat Bottom Cell Culture Plate	Kasvi	K12-024	Made of polystyrene with alphanumeric identification; The Cell Culture Plate is DNase, RNase and pyrogen-free and free of cytotoxic substances; Sterilized by gamma radiation;
Cell culture CO2 incubator	Sanyo	303082	A CO2 incubator serves to create and control conditions similar to a human body, thus allowing the in vitro growth and proliferation of different cell types.
Centrifuge Microtube (eppendorf type) 1.5 mL	Capp	5101500	Made from polypropylene, with a cap attached to the tube for opening and closing with just one hand. It has a polished interior against protein adhesion and for sample visibility, being free of DNase, RNase and Pyrogens
Circular coverslip 15 mm	Olen	K5-0015	Circular coverslips are used for microscopy techniques in cell culture. Made of super transparent translucent glass; with thickness of 0.13 mm
Class II Type B2 (Total Exhaust) Biosafety Cabinets	Esco Lifesciences group	2010274	Airstream Class II Type B2 Biosafety Cabinets (AB2) provide product, operator and environmental protection and are suitable for work with trace amounts of toxic chemicals and agents assigned to biological safety levels I, II or III. In a Class II Type B2 cabinet, all inflow and downflow air is exhausted after HEPA/ULPA filtration to the external environment without recirculation across the work surface.
Dextrose Potato Agar medium	Merck	145	Potato Dextrose Agar is used in the cultivation and enumeration of yeasts and fungi
EDTA vacuum blood collection tube	FirstLab	FL5-1109L	EDTA is the recommended anticoagulant for hematology routines as it is the best anticoagulant for preserving cell morphology.
Entellan	Merck	1.07961	Fixative agent; Entellan is a waterless mounting medium for permanent mounting for microscopy.
Fetal Bovine Serum	Gibco	A2720801	Fetal bovine serum (FBS) is a universal growth supplement of cell and tissue culture media. FBS is a natural cocktail of most of the factors required for cell attachment, growth, and proliferation, effective for most types of human and animal (including insect) cells.
Flaticon			database of images
Glycerol	Merck	24900988	The cryoprotectant agent glycerol is used for freezing cells and spores
Histopaque-1077			polysucrose solution
Image J			Image analysis software
Microscopy slides	Precision	7105	Slide for Microscopy 26 x 76 mm Matte Lapped Thickness 1.0 to 1.2 mm. Made of special optical glass and packaged with silk paper divider with high quality transparency free of imperfections
Mini centrifuge	Prism	C1801	The Prism Mini Centrifuge was designed to be extremely compact with an exceptionally small footprint. Includes 2 interchangeable quick-release rotors that spin up to 6000 rpm. An electronic brake provides quick deceleration and the self-opening lid allows easy access to the sample, reducing handling time.
Neubauer chamber	Kasvi	K5-0011	The Neubauer Counting Chamber is used for counting cells or other suspended particles.
Panoptic fast	Laborclin	620529	Laborclin's  panoptic fast c is a kit for quick staining in hematology
Penicillin/Streptomycin Solution – 10,000U	LGC- Biotechnology	BR3011001	antibiotic is used in order to avoid possible contamination by manipulation external to the laminar flow.
Petri dish 90 x 15 mm Smooth	Cralplast	18248	Disposable Petri dish; Made of highly transparent polystyrene (PS); flat bottom; Smooth;Size: 90 x 15 mm.
Phosphate buffered saline (PBS)	thermo fisher Scientific	10010001	PBS is a water-based saline solution with a simple formulation. It is isotonic and non-toxic to most cells. It includes sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock while maintaining the water balance of living cells.
Pipette Pasteur 3 mL Sterile	Accumax	AP-3-B-S	STERILE ACCUMAX PASTEUR 3 ML PIPETTE with 3 mL capacity, made of transparent low-density polyethylene (LDPE) and individually sterile
Refrigerated Centrifuge	Thermo Scientific	TS-HM16R	The Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R Refrigerated Centrifuge is a refrigerated centrifuge with the user-friendly control panel makes it easy to pre-set the speed, RCF value, running time, temperature, and running profile. The Megafuge 16R can reach maximum speeds of 15,200 RPM and maximum RCF of 25,830 x g.
RPMI-1640 Medium	Merck	MFCD00217820	HEPES Modification, with L-glutamine and 25 mM HEPES, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
The single channel micropipettes	Eppendorf	Z683809	Single-channel micropipettes are used to accurately transfer and measure very small amounts of liquids.
Tip for Micropipettor	Corning	4894	Capacity of 10 µL and 1,000 µL Autoclavable
Triocular inverted microscope	LABOMED	VU-7125500	It allows you to observe cells inside tubes and bottles, without having to open them, thus avoiding contamination problems.