Levedygtighedsanalyse af Trichoderma stromaticum conidia inde i humant perifert blod mononukleart afledt makrofager

Summary

Teknikken, der involverer fagocytose af svampekonidier ved makrofager, anvendes i vid udstrækning til undersøgelser, der evaluerer moduleringen af immunresponserne mod svampe. Formålet med dette manuskript er at præsentere en metode til evaluering af fagocytose og clearance evner af humant perifert blod mononukleare-afledte makrofager stimuleret med Trichoderma stromaticum conidier.

Abstract

Makrofager repræsenterer en afgørende forsvarslinje og er ansvarlige for at forhindre vækst og kolonisering af patogener i forskellige væv. Conidial fagocytose er en nøgleproces, der muliggør undersøgelse af de cytoplasmatiske og molekylære begivenheder involveret i makrofagpatogeninteraktioner samt til bestemmelse af dødstidspunktet for internaliserede konidier. Teknikken, der involverer fagocytose af svampekonidier ved makrofager, anvendes i vid udstrækning til undersøgelser, der evaluerer moduleringen af immunresponserne mod svampe. Unddragelse af fagocytose og flugt af fagosomer er mekanismer for svampevirulens. Her rapporterer vi de metoder, der kan bruges til analyse af fagocytose, clearance og levedygtighed af T. stromaticum conidia, en svamp, der anvendes som biokontrol- og biogødningsmiddel og er i stand til at fremkalde humane infektioner. Protokollen består af 1) Trichoderma-kultur , 2) vask for at opnå konidier, 3) isolering af mononukleære celler i perifert blod (PBMC’er) ved anvendelse af polysaccharoseopløsningsmetoden og differentiering af PBMC’erne i makrofager, 4) en in vitro-fagocytosemetode ved anvendelse af runde glasdæksler og farvning og 5) et clearanceassay til vurdering af konidiernes levedygtighed efter fagocytose af konidier. Sammenfattende kan disse teknikker bruges til at måle svampeclearance effektivitet af makrofager.

Introduction

Trichoderma-slægten (Order: Hypocreales, Family: Hypocreaceae) består af allestedsnærværende, saprofytiske svampe, der er parasitter af andre svampearter og er i stand til at producere en række kommercielt nyttige enzymer¹. Disse svampearter anvendes til fremstilling af heterologe proteiner², fremstilling af cellulose³, ethanol, øl, vin og papir⁴, i tekstilindustrien⁵, fødevareindustrien⁶ og i landbruget som biologiske bekæmpelsesmidler ^7,8. Ud over den industrielle interesse for disse svampearter har det stigende antal infektioner hos mennesker givet nogle Trichoderma-arter status som opportunistiske patogener⁹.

Trichoderma spp. vokser hurtigt i kultur, med oprindeligt hvide og bomuldsagtige kolonier, der bliver grønlig gul til mørkegrøn¹⁰. De er tilpasset til at leve i en bred vifte af pH- og temperaturforhold, og de opportunistiske arter er i stand til at overleve ved fysiologisk pH og temperaturer og dermed kolonisere forskellige humane væv 11,12,13. Det er vigtigt, at stigningen i infektionshastigheden for Trichoderma spp. kan være forbundet med virulensfaktorer, og disse er ikke godt undersøgt. Derudover er undersøgelser, der fokuserer på at forstå immunresponset mod opportunistiske Trichoderma-arter, stadig sjældne.

Under en infektion, sammen med neutrofiler, repræsenterer makrofager forsvarslinjen, der er ansvarlig for fagocytose, og forhindrer således vækst og kolonisering af patogener i forskellige væv. Ved hjælp af mønstergenkendelsesreceptorer, såsom tolllignende receptorer og C-type lektinreceptorer, makrofager fagocytosesvampe og behandler dem til fagosomer, hvilket fremmer et åndedrætsudbrud, frigivelsen af proinflammatoriske cytokiner og ødelæggelsen af de fagocytoserede mikroorganismer¹⁴. Fagocytosemekanismen kan imidlertid påvirkes og undgås af forskellige mikrobielle strategier, såsom svampecellernes størrelse og form; tilstedeværelsen af kapsler, der forhindrer fagocytose; faldende antallet af fagocytose-inducerende receptorer; ombygning af strukturen af actinfibre i cytoplasmaet; hindrer dannelsen af pseudopodier; og fagosom- eller fagosomflugt efter fagocytoseprocessen¹⁴.

Mange patogener, herunder Cryptococcus neoformans, bruger makrofager som en niche til at overleve i værten, sprede og fremkalde infektion¹⁵. Phagocytose og clearance assay bruges til at evaluere immunresponset mod patogener og til at identificere de mikrobielle strategier, der anvendes til at undgå det medfødte immunsystem 15,16,17. Denne type teknik kan også bruges til at undersøge differentialkinetikken af fagocytose, forsinket fagosomforsuring og oxidativ burst, der resulterer i reduceret svampedræbning¹⁸.

Forskellige metoder kan bruges til at evaluere fagocytose, svampeoverlevelse og unddragelse af fagosommodningsprocessen. Disse omfatter fluorescensmikroskopi, som bruges til at observere fagocytose, den cellulære placering og molekylerne produceret under fagocytose¹⁹; flowcytometri, som giver kvantitative data om fagocytose og bruges til at evaluere de forskellige markører, der er involveret i processen ^20,21; intravital mikroskopi, som bruges til at vurdere mikrobiel indfangning og fagosommodning²²; antistofmedieret fagocytose, som anvendes til at vurdere specificiteten af fagocytoseprocessen for et patogen²³; og andre 24,25,26,27.

Protokollen, der præsenteres her, anvender en almindelig, billig og direkte metode ved hjælp af et optisk mikroskop og pladevækstassay til vurdering af fagocytose og drab af svampekonidier. Denne protokol vil give læserne trinvise instruktioner til udførelse af fagocytose og clearance assay ved hjælp af humane perifere blod mononukleare-afledte makrofager udsat for T. stromaticum. PBMC’er blev brugt, fordi Trichoderma conidia anvendes som biokontrol mod phytopathogener og en biogødning til planteafgrøder over hele verden og har forårsaget flere humane infektioner, kaldet Trichodermosis. Derudover er der kun to tidligere værker, der fokuserer på interaktionen mellem Trichoderma conidia og det menneskelige immunsystem, hvor vi undersøgte neutrofiler²⁸ og autofagi i makrofager²⁹. Denne artikel viser først, hvordan fagocytosen af konidierne af T. stromaticum ved PBMC-afledte makrofager kan studeres, og derefter hvordan levedygtigheden af de opslugte konidier kan vurderes ved hjælp af enkle mikroskopibaserede teknikker. Denne protokol kan yderligere lette undersøgelser af makrofagassocieret immunrespons eller immunsystemmodulationsrelaterede mekanismer.

Protocol

Etiske overvejelser og menneskelige emnerAlle eksperimenter med mennesker beskrevet i denne undersøgelse blev udført i henhold til erklæringen fra Helsinki og brasilianske føderale love og godkendt af State University of Santa Cruz’s etiske komité (projektidentifikationskode: 550.382 / 2014). Humant perifert blod blev indsamlet fra raske frivillige fra Ilhéus by, Bahia, Brasilien, der ikke blev udsat for erhvervsmæssige aktiviteter relateret til den undersøgte svam…

Representative Results

Teknikken, der involverer fagocytose af svampekonidier ved makrofager, anvendes i vid udstrækning til undersøgelser, der evaluerer moduleringen af immunresponserne mod svampe. Vi brugte fagocytosen af T. stromaticum conidia til at vurdere levedygtigheden af konidierne efter fagocytose, da unddragelse af fagocytose og flugt af fagosomer er mekanismer for svampevirulens. Forskere bør udføre disse teknikker som et af de første assays, når de undersøger en art af klinisk interesse. <p class="jove_content …

Discussion

For flere svampepatogener, herunder Aspergillus fumigatus, Cryptococcus, Candida albicans og andre, er conidial eller gærfagocytose en nøgleproces, der muliggør undersøgelse af de cytoplasmatiske og molekylære begivenheder i makrofagpatogeninteraktioner såvel som til bestemmelse af dødstidspunktet for de internaliserede konidier 14,39,40. Phagocytose er nøgleprocessen i Trichoderma-værtsin…

Materials

15 mL centrifuge tubes	Corning	CLS431470	15 mL centrifuge tubes, polypropylene, conical bottom with lid, individually sterile
24-Well Flat Bottom Cell Culture Plate	Kasvi	K12-024	Made of polystyrene with alphanumeric identification; The Cell Culture Plate is DNase, RNase and pyrogen-free and free of cytotoxic substances; Sterilized by gamma radiation;
Cell culture CO2 incubator	Sanyo	303082	A CO2 incubator serves to create and control conditions similar to a human body, thus allowing the in vitro growth and proliferation of different cell types.
Centrifuge Microtube (eppendorf type) 1.5 mL	Capp	5101500	Made from polypropylene, with a cap attached to the tube for opening and closing with just one hand. It has a polished interior against protein adhesion and for sample visibility, being free of DNase, RNase and Pyrogens
Circular coverslip 15 mm	Olen	K5-0015	Circular coverslips are used for microscopy techniques in cell culture. Made of super transparent translucent glass; with thickness of 0.13 mm
Class II Type B2 (Total Exhaust) Biosafety Cabinets	Esco Lifesciences group	2010274	Airstream Class II Type B2 Biosafety Cabinets (AB2) provide product, operator and environmental protection and are suitable for work with trace amounts of toxic chemicals and agents assigned to biological safety levels I, II or III. In a Class II Type B2 cabinet, all inflow and downflow air is exhausted after HEPA/ULPA filtration to the external environment without recirculation across the work surface.
Dextrose Potato Agar medium	Merck	145	Potato Dextrose Agar is used in the cultivation and enumeration of yeasts and fungi
EDTA vacuum blood collection tube	FirstLab	FL5-1109L	EDTA is the recommended anticoagulant for hematology routines as it is the best anticoagulant for preserving cell morphology.
Entellan	Merck	1.07961	Fixative agent; Entellan is a waterless mounting medium for permanent mounting for microscopy.
Fetal Bovine Serum	Gibco	A2720801	Fetal bovine serum (FBS) is a universal growth supplement of cell and tissue culture media. FBS is a natural cocktail of most of the factors required for cell attachment, growth, and proliferation, effective for most types of human and animal (including insect) cells.
Flaticon			database of images
Glycerol	Merck	24900988	The cryoprotectant agent glycerol is used for freezing cells and spores
Histopaque-1077			polysucrose solution
Image J			Image analysis software
Microscopy slides	Precision	7105	Slide for Microscopy 26 x 76 mm Matte Lapped Thickness 1.0 to 1.2 mm. Made of special optical glass and packaged with silk paper divider with high quality transparency free of imperfections
Mini centrifuge	Prism	C1801	The Prism Mini Centrifuge was designed to be extremely compact with an exceptionally small footprint. Includes 2 interchangeable quick-release rotors that spin up to 6000 rpm. An electronic brake provides quick deceleration and the self-opening lid allows easy access to the sample, reducing handling time.
Neubauer chamber	Kasvi	K5-0011	The Neubauer Counting Chamber is used for counting cells or other suspended particles.
Panoptic fast	Laborclin	620529	Laborclin's  panoptic fast c is a kit for quick staining in hematology
Penicillin/Streptomycin Solution – 10,000U	LGC- Biotechnology	BR3011001	antibiotic is used in order to avoid possible contamination by manipulation external to the laminar flow.
Petri dish 90 x 15 mm Smooth	Cralplast	18248	Disposable Petri dish; Made of highly transparent polystyrene (PS); flat bottom; Smooth;Size: 90 x 15 mm.
Phosphate buffered saline (PBS)	thermo fisher Scientific	10010001	PBS is a water-based saline solution with a simple formulation. It is isotonic and non-toxic to most cells. It includes sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock while maintaining the water balance of living cells.
Pipette Pasteur 3 mL Sterile	Accumax	AP-3-B-S	STERILE ACCUMAX PASTEUR 3 ML PIPETTE with 3 mL capacity, made of transparent low-density polyethylene (LDPE) and individually sterile
Refrigerated Centrifuge	Thermo Scientific	TS-HM16R	The Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R Refrigerated Centrifuge is a refrigerated centrifuge with the user-friendly control panel makes it easy to pre-set the speed, RCF value, running time, temperature, and running profile. The Megafuge 16R can reach maximum speeds of 15,200 RPM and maximum RCF of 25,830 x g.
RPMI-1640 Medium	Merck	MFCD00217820	HEPES Modification, with L-glutamine and 25 mM HEPES, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
The single channel micropipettes	Eppendorf	Z683809	Single-channel micropipettes are used to accurately transfer and measure very small amounts of liquids.
Tip for Micropipettor	Corning	4894	Capacity of 10 µL and 1,000 µL Autoclavable
Triocular inverted microscope	LABOMED	VU-7125500	It allows you to observe cells inside tubes and bottles, without having to open them, thus avoiding contamination problems.