Levedyktighetsanalyse av Trichoderma stromaticum Conidia i humant perifert blod mononukleære makrofager

Summary

Teknikken som involverer fagocytose av soppkonidier av makrofager, er mye brukt til studier som evaluerer moduleringen av immunresponsene mot sopp. Formålet med dette manuskriptet er å presentere en metode for å evaluere fagocytose- og clearanceevnen til mononukleære makrofager fra humant perifert blod stimulert med Trichoderma stromaticum conidia.

Abstract

Makrofager representerer en avgjørende forsvarslinje og er ansvarlige for å forhindre vekst og kolonisering av patogener i forskjellige vev. Conidial fagocytose er en nøkkelprosess som muliggjør undersøkelse av cytoplasmatiske og molekylære hendelser involvert i makrofag-patogen-interaksjoner, samt for bestemmelse av dødstidspunktet for internaliserte konidier. Teknikken som involverer fagocytose av soppkonidier av makrofager, er mye brukt til studier som evaluerer moduleringen av immunresponsene mot sopp. Unnvikelsen av fagocytose og rømning av fagosomer er mekanismer for soppvirulens. Her rapporterer vi metodene som kan brukes til analyse av fagocytose, clearance og levedyktighet av T. stromaticum conidia, en sopp som brukes som biokontroll- og biogjødselmiddel og er i stand til å indusere menneskelige infeksjoner. Protokollen består av 1) Trichoderma-kultur , 2) vasking for å oppnå konidier, 3) isolering av mononukleære celler i perifert blod (PBMC) ved bruk av polysukroseløsningsmetoden og differensiering av PBMCene i makrofager, 4) en in vitro-fagocytosemetode ved bruk av runde glassdeksel og farging, og 5) en clearance-analyse for å vurdere konidiens levedyktighet etter konidiafagocytose. Oppsummert kan disse teknikkene brukes til å måle soppclearanceeffektiviteten til makrofager.

Introduction

Trichoderma-slekten (Orden: Hypocreales, Familie: Hypocreaceae) består av allestedsnærværende, saprofytiske sopp som er parasitter av andre sopparter og er i stand til å produsere en rekke kommersielt nyttige enzymer¹. Disse soppartene brukes til produksjon av heterologe proteiner², produksjon av cellulose³, etanol, øl, vin og papir⁴, i tekstilindustrien⁵, næringsmiddelindustrien⁶ og i landbruket som biologiske kontrollmidler ^7,8. I tillegg til den industrielle interessen for disse soppartene, har det økende antallet infeksjoner hos mennesker gitt noen Trichoderma-arter status som opportunistiske patogener⁹.

Trichoderma spp. vokser raskt i kulturen, med i utgangspunktet hvite og bomullsaktige kolonier som blir grønngule til mørkegrønne¹⁰. De er tilpasset til å leve i et bredt spekter av pH- og temperaturforhold, og de opportunistiske artene er i stand til å overleve ved fysiologisk pH og temperaturer og dermed kolonisere forskjellige menneskelige vev 11,12,13. Det er viktig at økningen i infeksjonsraten av Trichoderma spp. kan være forbundet med virulensfaktorer, og disse er ikke godt studert. I tillegg er studier som fokuserer på å forstå immunresponsen mot opportunistiske Trichoderma-arter fortsatt sjeldne.

Under en infeksjon, sammen med nøytrofiler, representerer makrofager forsvarslinjen som er ansvarlig for fagocytose, og forhindrer dermed vekst og kolonisering av patogener i forskjellige vev. Ved hjelp av mønstergjenkjenningsreseptorer, som Toll-lignende reseptorer og C-type lektinreseptorer, makrofager fagocytose sopp og behandler dem i fagolysosomer, og fremmer dermed et respiratorisk utbrudd, frigjøring av proinflammatoriske cytokiner og ødeleggelsen av fagocytoserte mikroorganismer¹⁴. Mekanismen for fagocytose kan imidlertid påvirkes og unngås av forskjellige mikrobielle strategier, for eksempel størrelsen og formen på soppcellene; Tilstedeværelsen av kapsler som hindrer fagocytose; redusere antall fagocytose-induserende reseptorer; ombyggingen av strukturen av aktinfibre i cytoplasma; hindrer dannelsen av pseudopodi; og fagosom eller fagolysosom unnslipper etter fagocytoseprosessen¹⁴.

Mange patogener, inkludert Cryptococcus neoformans, bruker makrofager som en nisje for å overleve i verten, spre og indusere infeksjon¹⁵. Fagocytose- og clearanceanalysen brukes til å evaluere immunresponsen mot patogener og for å identifisere de mikrobielle strategiene som brukes for å unngå det medfødte immunsystemet 15,16,17. Denne typen teknikk kan også brukes til å undersøke differensialkinetikken til fagocytose, forsinket fagosomforsuring og oksidativt utbrudd som resulterer i redusert soppdrap¹⁸.

Ulike metoder kan brukes til å evaluere fagocytose, soppoverlevelse og unnvikelse av fagosommodningsprosessen. Disse inkluderer fluorescensmikroskopi, som brukes til å observere fagocytose, den cellulære plasseringen og molekylene produsert under fagocytose¹⁹; flowcytometri, som gir kvantitative data om fagocytose og brukes til å evaluere de forskjellige markørene som er involvert i prosessen^20,21; intravital mikroskopi, som brukes til å vurdere mikrobiell fangst og fagosommodning²²; antistoffmediert fagocytose, som brukes til å vurdere spesifisiteten av fagocytoseprosessen for et patogen²³; og andre 24,25,26,27.

Protokollen som presenteres her benytter en vanlig, billig og direkte metode ved hjelp av et optisk mikroskop og platevekstanalyse for å vurdere fagocytose og drap av soppkonidier. Denne protokollen vil gi leserne trinnvise instruksjoner for å utføre fagocytose og clearance-analysen ved bruk av humane perifere blodmononukleære makrofager utsatt for T. stromaticum. PBMC ble brukt fordi Trichoderma conidia brukes som biokontroll mot fytopatogener og biogjødsel for planteavlinger over hele verden og har forårsaket flere menneskelige infeksjoner, kalt Trichodermosis. Dessuten er det bare to tidligere arbeider som fokuserer på samspillet mellom Trichoderma conidia og det menneskelige immunsystemet, der vi undersøkte nøytrofiler²⁸ og autofagi i makrofager²⁹. Denne artikkelen viser først hvordan fagocytose av konidiene til T. stromaticum av PBMC-avledede makrofager kan studeres, og deretter hvordan levedyktigheten til de oppslukte konidiene kan vurderes ved hjelp av enkle mikroskopibaserte teknikker. Denne protokollen kan ytterligere lette undersøkelser av makrofagassosiert immunrespons eller immunsystemmodulasjonsrelaterte mekanismer.

Protocol

Etiske overveielser og menneskerAlle eksperimenter med mennesker beskrevet i denne studien ble utført i henhold til Helsinkideklarasjonen og brasilianske føderale lover og godkjent av State University of Santa Cruz etiske komité (prosjektidentifikasjonskode: 550.382 / 2014). Humant perifert blod ble samlet fra friske frivillige fra Ilhéus city, Bahia, Brasil, ikke utsatt for yrkesaktiviteter relatert til den studerte soppen. Personer med rapporterte helsemedisinske til…

Representative Results

Teknikken som involverer fagocytose av soppkonidier av makrofager, er mye brukt til studier som evaluerer moduleringen av immunresponsene mot sopp. Vi brukte fagocytose av T. stromaticum conidia for å vurdere levedyktigheten til konidiene etter fagocytose, siden unnvikelsen av fagocytose og rømningen av fagosomer er mekanismer for soppvirulens. Forskere bør utføre disse teknikkene som en av de første analysene når de undersøker en art av klinisk interesse. <p class="jove_content biglegend" fo:keep-tog…

Discussion

For flere sopppatogener, inkludert Aspergillus fumigatus, Cryptococcus, Candida albicans og andre, er conidial eller gjærfagocytose en nøkkelprosess som muliggjør undersøkelse av cytoplasmatiske og molekylære hendelser i makrofag-patogen-interaksjoner, samt for bestemmelse av dødstidspunktet for den internaliserte konidien 14,39,40. Fagocytose er nøkkelprosessen i Trichoderma-vert-interaksjo…

Materials

15 mL centrifuge tubes	Corning	CLS431470	15 mL centrifuge tubes, polypropylene, conical bottom with lid, individually sterile
24-Well Flat Bottom Cell Culture Plate	Kasvi	K12-024	Made of polystyrene with alphanumeric identification; The Cell Culture Plate is DNase, RNase and pyrogen-free and free of cytotoxic substances; Sterilized by gamma radiation;
Cell culture CO2 incubator	Sanyo	303082	A CO2 incubator serves to create and control conditions similar to a human body, thus allowing the in vitro growth and proliferation of different cell types.
Centrifuge Microtube (eppendorf type) 1.5 mL	Capp	5101500	Made from polypropylene, with a cap attached to the tube for opening and closing with just one hand. It has a polished interior against protein adhesion and for sample visibility, being free of DNase, RNase and Pyrogens
Circular coverslip 15 mm	Olen	K5-0015	Circular coverslips are used for microscopy techniques in cell culture. Made of super transparent translucent glass; with thickness of 0.13 mm
Class II Type B2 (Total Exhaust) Biosafety Cabinets	Esco Lifesciences group	2010274	Airstream Class II Type B2 Biosafety Cabinets (AB2) provide product, operator and environmental protection and are suitable for work with trace amounts of toxic chemicals and agents assigned to biological safety levels I, II or III. In a Class II Type B2 cabinet, all inflow and downflow air is exhausted after HEPA/ULPA filtration to the external environment without recirculation across the work surface.
Dextrose Potato Agar medium	Merck	145	Potato Dextrose Agar is used in the cultivation and enumeration of yeasts and fungi
EDTA vacuum blood collection tube	FirstLab	FL5-1109L	EDTA is the recommended anticoagulant for hematology routines as it is the best anticoagulant for preserving cell morphology.
Entellan	Merck	1.07961	Fixative agent; Entellan is a waterless mounting medium for permanent mounting for microscopy.
Fetal Bovine Serum	Gibco	A2720801	Fetal bovine serum (FBS) is a universal growth supplement of cell and tissue culture media. FBS is a natural cocktail of most of the factors required for cell attachment, growth, and proliferation, effective for most types of human and animal (including insect) cells.
Flaticon			database of images
Glycerol	Merck	24900988	The cryoprotectant agent glycerol is used for freezing cells and spores
Histopaque-1077			polysucrose solution
Image J			Image analysis software
Microscopy slides	Precision	7105	Slide for Microscopy 26 x 76 mm Matte Lapped Thickness 1.0 to 1.2 mm. Made of special optical glass and packaged with silk paper divider with high quality transparency free of imperfections
Mini centrifuge	Prism	C1801	The Prism Mini Centrifuge was designed to be extremely compact with an exceptionally small footprint. Includes 2 interchangeable quick-release rotors that spin up to 6000 rpm. An electronic brake provides quick deceleration and the self-opening lid allows easy access to the sample, reducing handling time.
Neubauer chamber	Kasvi	K5-0011	The Neubauer Counting Chamber is used for counting cells or other suspended particles.
Panoptic fast	Laborclin	620529	Laborclin's  panoptic fast c is a kit for quick staining in hematology
Penicillin/Streptomycin Solution – 10,000U	LGC- Biotechnology	BR3011001	antibiotic is used in order to avoid possible contamination by manipulation external to the laminar flow.
Petri dish 90 x 15 mm Smooth	Cralplast	18248	Disposable Petri dish; Made of highly transparent polystyrene (PS); flat bottom; Smooth;Size: 90 x 15 mm.
Phosphate buffered saline (PBS)	thermo fisher Scientific	10010001	PBS is a water-based saline solution with a simple formulation. It is isotonic and non-toxic to most cells. It includes sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock while maintaining the water balance of living cells.
Pipette Pasteur 3 mL Sterile	Accumax	AP-3-B-S	STERILE ACCUMAX PASTEUR 3 ML PIPETTE with 3 mL capacity, made of transparent low-density polyethylene (LDPE) and individually sterile
Refrigerated Centrifuge	Thermo Scientific	TS-HM16R	The Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R Refrigerated Centrifuge is a refrigerated centrifuge with the user-friendly control panel makes it easy to pre-set the speed, RCF value, running time, temperature, and running profile. The Megafuge 16R can reach maximum speeds of 15,200 RPM and maximum RCF of 25,830 x g.
RPMI-1640 Medium	Merck	MFCD00217820	HEPES Modification, with L-glutamine and 25 mM HEPES, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
The single channel micropipettes	Eppendorf	Z683809	Single-channel micropipettes are used to accurately transfer and measure very small amounts of liquids.
Tip for Micropipettor	Corning	4894	Capacity of 10 µL and 1,000 µL Autoclavable
Triocular inverted microscope	LABOMED	VU-7125500	It allows you to observe cells inside tubes and bottles, without having to open them, thus avoiding contamination problems.