Tekniken som involverar fagocytos av svampkonidier av makrofager används i stor utsträckning för studier som utvärderar moduleringen av immunsvaret mot svampar. Syftet med detta manuskript är att presentera en metod för att utvärdera fagocytos och clearanceförmåga hos humana mononukleära makrofager i perifert blod stimulerade med Trichoderma stromaticum conidia.
Makrofager utgör en viktig försvarslinje och är ansvariga för att förhindra tillväxt och kolonisering av patogener i olika vävnader. Konidial fagocytos är en nyckelprocess som möjliggör undersökning av cytoplasmatiska och molekylära händelser som är involverade i makrofag-patogeninteraktioner, samt för bestämning av tidpunkten för döden av internaliserad konidi. Tekniken som involverar fagocytos av svampkonidier av makrofager används i stor utsträckning för studier som utvärderar moduleringen av immunsvaret mot svampar. Undvikande av fagocytos och flykt av fagosomer är mekanismer för svampvirulens. Här redovisar vi de metoder som kan användas för analys av fagocytos, clearance och livsduglighet hos T. stromaticum conidia, en svamp som används som biobekämpning och biogödselmedel och som kan inducera infektioner hos människor. Protokollet består av 1) Trichoderma-odling , 2) tvättning för att erhålla konidier, 3) isolering av mononukleära celler i perifert blod (PBMC) med hjälp av polysackaroslösningsmetoden och differentiering av PBMC till makrofager, 4) en in vitro-fagocytosmetod med hjälp av runda glastäckglas och färgning, och 5) en clearance-analys för att bedöma konidiernas livskraft efter konidifagocytos. Sammanfattningsvis kan dessa tekniker användas för att mäta svampelimineringen av makrofager.
Släktet Trichoderma (Ordning: Hypocreales, Familj: Hypocreaceae) består av allestädes närvarande, saprofytiska svampar som är parasiter på andra svamparter och som kan producera en rad kommersiellt användbara enzymer. Dessa svamparter används för produktion av heterologa proteiner2, produktion av cellulosa3, etanol, öl, vin och papper4, inom textilindustrin5, livsmedelsindustrin6 och inom jordbruket som biologiska bekämpningsmedel 7,8. Förutom det industriella intresset för dessa svamparter har det ökande antalet infektioner hos människor gett vissa Trichoderma-arter status som opportunistiska patogener9.
Trichoderma spp. växer snabbt i odling, med till en början vita och bomullsartade kolonier som blir gröngula till mörkgröna10. De är anpassade för att leva i ett brett spektrum av pH- och temperaturförhållanden, och de opportunistiska arterna kan överleva vid fysiologiska pH och temperaturer och därmed kolonisera olika mänskliga vävnader 11,12,13. Det är viktigt att notera att ökningen av infektionsfrekvensen hos Trichoderma spp. kan vara förknippad med virulensfaktorer, och dessa är inte väl studerade. Dessutom är studier som fokuserar på att förstå immunsvaret mot opportunistiska Trichoderma-arter fortfarande sällsynta.
Under en infektion, tillsammans med neutrofiler, representerar makrofager försvarslinjen som är ansvarig för fagocytos och förhindrar därmed tillväxt och kolonisering av patogener i olika vävnader. Med hjälp av mönsterigenkänningsreceptorer, såsom Toll-liknande receptorer och lektinreceptorer av C-typ, fagocytossvampar och bearbetar dem till fagolysosomer, vilket främjar en andningsbristning, frisättning av proinflammatoriska cytokiner och förstörelse av de fagocytoserade mikroorganismerna14. Mekanismen för fagocytos kan dock påverkas och undvikas av olika mikrobiella strategier, såsom svampcellernas storlek och form; närvaron av kapslar som hindrar fagocytos; minska antalet fagocytosinducerande receptorer; ombyggnad av strukturen av aktinfibrer i cytoplasman; hindrar bildandet av pseudopodier; och fagosomen eller fagolysosomen flyr efter fagocytosprocessen14.
Många patogener, inklusive Cryptococcus neoformans, använder makrofager som en nisch för att överleva i värden, sprida sig och inducera infektion15. Fagocytos- och clearanceanalysen används för att utvärdera immunsvaret mot patogener och för att identifiera de mikrobiella strategier som används för att undvika det medfödda immunsystemet 15,16,17. Denna typ av teknik kan också användas för att undersöka den differentiella kinetiken för fagocytos, fördröjd fagosomförsurning och oxidativ burst som resulterar i minskadsvampdöd.
Olika metoder kan användas för att utvärdera fagocytos, svampöverlevnad och undvikande av fagosommognadsprocessen. Dessa inkluderar fluorescensmikroskopi, som används för att observera fagocytos, cellulär lokalisering och de molekyler som produceras under fagocytos19; flödescytometri, som ger kvantitativa data om fagocytos och används för att utvärdera de olika markörer som är involverade i processen20,21; intravital mikroskopi, som används för att bedöma mikrobiell infångning och fagosommognad22; Antikroppsmedierad fagocytos, som används för att bedöma specificiteten hos fagocytosprocessen för en patogen23. och andra 24,25,26,27.
Protokollet som presenteras här använder en vanlig, billig och direkt metod som använder ett optiskt mikroskop och platttillväxtanalys för att bedöma fagocytos och avdödning av svampkonidier. Detta protokoll kommer att ge läsarna steg-för-steg-instruktioner för att utföra fagocytos- och clearanceanalysen med hjälp av humana mononukleära makrofager från perifert blod som exponerats för T. stromaticum. PBMC användes eftersom Trichoderma conidia används som en biologisk bekämpning mot fytopatogener och ett biogödselmedel för växtgrödor över hela världen och har orsakat flera infektioner hos människor, så kallad Trichodermosis. Utöver det finns det bara två tidigare arbeten som fokuserar på interaktionen mellan Trichoderma conidia och det mänskliga immunsystemet, där vi undersökte neutrofiler28 och autofagi i makrofager29. Denna artikel visar först hur fagocytosen av konidierna hos T. stromaticum av PBMC-härledda makrofager kan studeras, och sedan hur livskraften hos de uppslukade konidierna kan bedömas med hjälp av enkla mikroskopibaserade tekniker. Detta protokoll kan ytterligare underlätta undersökningar av makrofagassocierat immunsvar eller immunsystemmoduleringsrelaterade mekanismer.
För flera svamppatogener inklusive Aspergillus fumigatus, Cryptococcus, Candida albicans och andra, är konidial eller jästfagocytos en nyckelprocess som möjliggör undersökning av cytoplasmatiska och molekylära händelser i makrofag-patogeninteraktioner, såväl som för bestämning av tidpunkten för döden av den internaliserade konidien 14,39,40. Fagocytos är nyckelprocessen i interaktion…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av följande brasilianska finansinstitut: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) med bidrag RED0011/2012 och RED008/2014. U.R.S., J.O.C. och M.E.S.M. erkänner stipendiet som beviljats av Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) respektive FAPESB.
15 mL centrifuge tubes | Corning | CLS431470 | 15 mL centrifuge tubes, polypropylene, conical bottom with lid, individually sterile |
24-Well Flat Bottom Cell Culture Plate | Kasvi | K12-024 | Made of polystyrene with alphanumeric identification; The Cell Culture Plate is DNase, RNase and pyrogen-free and free of cytotoxic substances; Sterilized by gamma radiation; |
Cell culture CO2 incubator | Sanyo | 303082 | A CO2 incubator serves to create and control conditions similar to a human body, thus allowing the in vitro growth and proliferation of different cell types. |
Centrifuge Microtube (eppendorf type) 1.5 mL | Capp | 5101500 | Made from polypropylene, with a cap attached to the tube for opening and closing with just one hand. It has a polished interior against protein adhesion and for sample visibility, being free of DNase, RNase and Pyrogens |
Circular coverslip 15 mm | Olen | K5-0015 | Circular coverslips are used for microscopy techniques in cell culture. Made of super transparent translucent glass; with thickness of 0.13 mm |
Class II Type B2 (Total Exhaust) Biosafety Cabinets | Esco Lifesciences group | 2010274 | Airstream Class II Type B2 Biosafety Cabinets (AB2) provide product, operator and environmental protection and are suitable for work with trace amounts of toxic chemicals and agents assigned to biological safety levels I, II or III. In a Class II Type B2 cabinet, all inflow and downflow air is exhausted after HEPA/ULPA filtration to the external environment without recirculation across the work surface. |
Dextrose Potato Agar medium | Merck | 145 | Potato Dextrose Agar is used in the cultivation and enumeration of yeasts and fungi |
EDTA vacuum blood collection tube | FirstLab | FL5-1109L | EDTA is the recommended anticoagulant for hematology routines as it is the best anticoagulant for preserving cell morphology. |
Entellan | Merck | 1.07961 | Fixative agent; Entellan is a waterless mounting medium for permanent mounting for microscopy. |
Fetal Bovine Serum | Gibco | A2720801 | Fetal bovine serum (FBS) is a universal growth supplement of cell and tissue culture media. FBS is a natural cocktail of most of the factors required for cell attachment, growth, and proliferation, effective for most types of human and animal (including insect) cells. |
Flaticon | database of images | ||
Glycerol | Merck | 24900988 | The cryoprotectant agent glycerol is used for freezing cells and spores |
Histopaque-1077 | polysucrose solution | ||
Image J | Image analysis software | ||
Microscopy slides | Precision | 7105 | Slide for Microscopy 26 x 76 mm Matte Lapped Thickness 1.0 to 1.2 mm. Made of special optical glass and packaged with silk paper divider with high quality transparency free of imperfections |
Mini centrifuge | Prism | C1801 | The Prism Mini Centrifuge was designed to be extremely compact with an exceptionally small footprint. Includes 2 interchangeable quick-release rotors that spin up to 6000 rpm. An electronic brake provides quick deceleration and the self-opening lid allows easy access to the sample, reducing handling time. |
Neubauer chamber | Kasvi | K5-0011 | The Neubauer Counting Chamber is used for counting cells or other suspended particles. |
Panoptic fast | Laborclin | 620529 | Laborclin's panoptic fast c is a kit for quick staining in hematology |
Penicillin/Streptomycin Solution – 10,000U | LGC- Biotechnology | BR3011001 | antibiotic is used in order to avoid possible contamination by manipulation external to the laminar flow. |
Petri dish 90 x 15 mm Smooth | Cralplast | 18248 | Disposable Petri dish; Made of highly transparent polystyrene (PS); flat bottom; Smooth;Size: 90 x 15 mm. |
Phosphate buffered saline (PBS) | thermo fisher Scientific | 10010001 | PBS is a water-based saline solution with a simple formulation. It is isotonic and non-toxic to most cells. It includes sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock while maintaining the water balance of living cells. |
Pipette Pasteur 3 mL Sterile | Accumax | AP-3-B-S | STERILE ACCUMAX PASTEUR 3 ML PIPETTE with 3 mL capacity, made of transparent low-density polyethylene (LDPE) and individually sterile |
Refrigerated Centrifuge | Thermo Scientific | TS-HM16R | The Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R Refrigerated Centrifuge is a refrigerated centrifuge with the user-friendly control panel makes it easy to pre-set the speed, RCF value, running time, temperature, and running profile. The Megafuge 16R can reach maximum speeds of 15,200 RPM and maximum RCF of 25,830 x g. |
RPMI-1640 Medium | Merck | MFCD00217820 | HEPES Modification, with L-glutamine and 25 mM HEPES, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture |
The single channel micropipettes | Eppendorf | Z683809 | Single-channel micropipettes are used to accurately transfer and measure very small amounts of liquids. |
Tip for Micropipettor | Corning | 4894 | Capacity of 10 µL and 1,000 µL Autoclavable |
Triocular inverted microscope | LABOMED | VU-7125500 | It allows you to observe cells inside tubes and bottles, without having to open them, thus avoiding contamination problems. |