Præsenteret her er udviklingen for konsekvent at erhverve højkvalitets dorsal rod ganglion kryostatsektioner.
Højkvalitets mus dorsal rod ganglion (DRG) kryostat sektioner er afgørende for korrekt immunkemi farvning og RNAscope undersøgelser i forskningen af inflammatoriske og neuropatiske smerter, kløe, samt andre perifere neurologiske tilstande. Det er dog stadig en udfordring konsekvent at opnå intakte og flade kryostatsektioner af høj kvalitet på glasglas på grund af DRG-vævets lille prøvestørrelse. Indtil videre er der ingen artikel, der beskriver en optimal protokol til DRG-kryosektionering. Denne protokol præsenterer en trinvis metode til at løse de ofte opståede vanskeligheder forbundet med DRG-kryosektion. Den præsenterede artikel forklarer, hvordan man fjerner den omgivende væske fra DRG-vævsprøverne, placerer DRG-sektionerne på diaset vendt mod samme retning og flader sektionerne på glasglasset uden at bue op. Selvom denne protokol er udviklet til kryosektionering af DRG-prøverne, kan den anvendes til kryosektionering af mange andre væv med en lille prøvestørrelse.
Dorsalrodganglionen (DRG) indeholder de primære sensoriske neuroner, vævsmakrofagerne og satellitcellerne, der omgiver de primære sensoriske neuroner 1,2,3,4. Det er en vigtig anatomisk struktur i behandlingen af uskadelige og skadelige signaler og spiller kritiske roller i smerte, kløe og forskellige perifere nervesygdomme 5,6,7,8,9,10,11,12,13. Selvom der er udviklet flere metoder til at dissekere DRG-væv fra musens rygmarv14,15,16, er kryosektionering af DRG-vævet fortsat udfordrende, da DRG-vævet er ret lille, og kryostatsektioner af DRG-prøver har tendens til at kurve i ruller, hvilket gør det vanskeligt at overføre kryostatsektionerne korrekt til glasglas. Imidlertid er korrekt kryosektion af DRG-vævet afgørende for immunhistokemiske undersøgelser og strukturen af DRG-sensoriske neuroner 17,18,19,20,21,22,23. Da enkeltcellede RNA-sekventeringsresultater desuden har afsløret den bemærkelsesværdige heterogenitet af DRG-sensoriske neuroner hos både mennesker24 og mus25, er korrekt kryosektion af DRG-væv afgørende for at undersøge forskellige DRG-cellers funktionelle rolle under forskellige fysiologiske og patologiske tilstande.
Selvom vævsrensningsteknikken er blevet anvendt til at undersøge 3D-rekonstruktionen af DRG26 som en alternativ teknik til kryosektion af DRG, er vævsrensningsteknikken tids- og arbejdskrævende. Til sammenligning er kryosektion af DRG hurtig og relativt let at udføre, og det er derfor fortsat en nøgleteknik til immunhistokemi og strukturstudier af DRG og andre regioner i centralnervesystemet. Imidlertid er det stadig en udfordring at opnå intakte og flade kryostatsektioner af høj kvalitet på glasglas i neurovidenskabelig forskning på grund af den lille prøvestørrelse af væv, som DRG og visse hjerneområder, og der er ingen artikel, der beskriver den optimale protokol på dette tidspunkt til kryosektionering af små vævsprøver, såsom muse-DRG’er.
Denne protokol giver en nem, trin-for-trin teknik til kryostatsektionering af musens DRG for pålideligt at opnå så mange DRG-sektioner af høj kvalitet på diasene til efterfølgende DRG-undersøgelser. Selvom den er specielt designet til kryosektionering af DRG-prøver, kan denne teknik potentielt bruges til kryosektionering af forskellige andre væv med en lille prøvestørrelse.
Denne protokol giver en nem trin-for-trin procedure til kryostatsektionering af musens DRG for pålideligt at opnå DRG-sektioner af høj kvalitet på dias. Der er fire kritiske trin i denne protokol. Først skal DRG-prøven og pincetten være tørre, før DRG-prøven lægges på basis-OLT. Enhver væske, der omgiver DRG-prøven, vil danne en isskal omkring den, hvilket resulterer i, at DRG-sektioner adskilles fra OCT og buer op. For det andet, hvis aluminiumsblokken ikke har et mærke, eller hvis basen OCT dækker mærk…
The authors have nothing to disclose.
Ingen.
Avertin | Sigma-Aldrich | T48402-25G | Anesthetize animal |
Epredia Cryotome Cryostat Cryocassettes, 25 mm dia. Crosshatched | Fisherbrand | 1910 | Hold the OCT section at the bottom |
Ergo Tweezers | Fisherbrand | S95310 | Using the end of a tweezer to gently touch the bottom (6 o’clock) of the section so that it sticks to the platform surface to prevent the section from curving back in a roll |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 1255015 | To collect the DRG section |
Marking pens | Fisherbrand | 133794 | Mark the orientation of base OCT |
Scigen Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisherbrand | 23730571 | Embedding medium for frozen tissue specimens to ensure optimal cutting temperature (O.C.T.). |