Um procedimento para criossecção do gânglio da raiz dorsal de camundongos

Summary

Apresentamos aqui o desenvolvimento para a aquisição consistente de cortes criostato de gânglio da raiz dorsal de alta qualidade.

Abstract

Cortes de criostato de alta qualidade do gânglio da raiz dorsal de camundongos (DRG) são cruciais para a coloração imunoquímica adequada e estudos de RNAscope na pesquisa de dor inflamatória e neuropática, coceira, bem como outras condições neurológicas periféricas. No entanto, continua sendo um desafio obter consistentemente seções de criostato de alta qualidade, intactas e planas em lâminas de vidro devido ao tamanho minúsculo da amostra do tecido DRG. Até o momento, não há nenhum artigo descrevendo um protocolo ideal para criossecção DRG. Este protocolo apresenta um método passo-a-passo para resolver as dificuldades frequentemente encontradas associadas à criossecção DRG. O artigo apresentado explica como remover o líquido circundante das amostras de tecido DRG, colocar as seções DRG na lâmina voltadas para a mesma orientação e achatar as seções na lâmina de vidro sem se curvar. Embora este protocolo tenha sido desenvolvido para a criossecção de amostras DRG, ele pode ser aplicado para a criossecção de muitos outros tecidos com um pequeno tamanho amostral.

Introduction

O gânglio da raiz dorsal (DRG) contém os neurônios sensoriais primários, os macrófagos teciduais e as células satélites que circundam os neurônios sensoriais primários 1,2,3,4. É uma estrutura anatômica chave no processamento de sinais inócuos e nocivos, e desempenha papéis críticos na dor, prurido e vários distúrbios dos nervos periféricos 5,6,7,8,9,10,11,12,13. Embora vários métodos tenham sido desenvolvidos para dissecar o tecido DRG da medula espinhal de camundongos^14,15,16, a criossecção do tecido DRG permanece desafiadora, pois o tecido DRG é muito pequeno, e cortes criostato de amostras DRG tendem a curvar-se em rolos^, dificultando a transferência adequada das seções de criostato para lâminas de vidro. Entretanto, a criossecção adequada do tecido DRG é crucial para estudos imunohistoquímicos e para a estrutura dos neurônios sensoriais DRG 17,18,19,20,21,22,23. Além disso, como os resultados do sequenciamento de RNA de célula única revelaram a notável heterogeneidade dos neurônios sensoriais DRG em humanos²⁴ e camundongos²⁵, a criossecção adequada do tecido DRG é crítica para investigar o papel funcional de diferentes células DRG em várias condições fisiológicas e patológicas.

Embora a técnica de limpeza de tecido tenha sido aplicada para investigar a reconstrução 3D do DRG²⁶ como uma técnica alternativa de criossecção do DRG, a técnica de limpeza de tecido é demorada e trabalhosa. Em comparação, a criossecção do DRG é rápida e relativamente fácil de ser realizada, sendo, portanto, uma técnica chave para estudos imunohistoquímicos e estruturais do DRG e de outras regiões do sistema nervoso central. No entanto, a obtenção de seções de criostato de alta qualidade, intactas e planas em lâminas de vidro continua a ser um desafio na pesquisa em neurociência devido ao tamanho minúsculo da amostra de tecidos, como o DRG e certas regiões cerebrais, e não há nenhum artigo descrevendo o protocolo ideal neste momento para criossecção de amostras de tecido de pequeno tamanho, como DRGs de camundongo.

Este protocolo fornece uma técnica fácil e passo a passo para a secção em criostato do DRG do rato para obter de forma fiável o maior número de secções DRG de alta qualidade nas lâminas para estudos DRG subsequentes. Embora especificamente projetada para criossecção de amostras DRG, esta técnica pode potencialmente ser usada para criossecção de vários outros tecidos com um tamanho de amostra pequeno.

Protocol

Para o presente estudo, os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UCSF e conduzidos de acordo com o NIH Guide for the Care and Use of Laboratory animals. Camundongos adultos C57BL/6 machos e fêmeas (criados internamente) com 8-12 semanas de idade foram usados aqui. 1. Preparação da amostra DRG Anestesiar os camundongos com 2,5% de Avertin (ver Tabela de Materiais). Garantir anestesia ade…

Representative Results

O presente estudo coletou cerca de 16 seções DRG contínuas e de alta qualidade de um camundongo L4 DRG. Os cortes obtidos foram sem distorção. A Figura 1 mostra o passo a passo para a criossecção. A retirada de líquido extra dos cortes teciduais é mostrada na Figura 2. O processo de inclusão dos tecidos pela OCT é destacado na Figura 3. A Figura 4 mostra o posicionamento adequado das seções…

Discussion

Este protocolo fornece um procedimento passo-a-passo fácil para a secção criostato do DRG do mouse para obter seções DRG de alta qualidade em lâminas de forma confiável. Há quatro etapas críticas neste protocolo. Primeiro, a amostra DRG e a pinça devem estar secas antes de colocar a amostra DRG na OCT base. Qualquer líquido ao redor da amostra DRG formará uma camada de gelo ao seu redor, resultando em seções DRG se separando da OCT e curvando-se. Em segundo lugar, se o bloco de alumínio não tiver uma marc…

Materials

Avertin	Sigma-Aldrich	T48402-25G	Anesthetize animal
Epredia Cryotome Cryostat Cryocassettes, 25 mm dia. Crosshatched	Fisherbrand	1910	Hold the OCT section at the bottom
Ergo Tweezers	Fisherbrand	S95310	Using the end of a tweezer to gently touch the bottom (6 o’clock) of the section so that it sticks to the platform surface to prevent the section from curving back in a roll
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisherbrand	1255015	To collect the DRG section
Marking pens	Fisherbrand	133794	Mark the orientation of base OCT
Scigen Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisherbrand	23730571	Embedding medium for frozen tissue specimens to ensure optimal cutting temperature (O.C.T.).