Cuantificación basada en imágenes de alto rendimiento de la síntesis y distribución del ADN mitocondrial
Summary
Se describe un procedimiento para estudiar la dinámica del metabolismo del ADN mitocondrial (ADNmt) en las células utilizando un formato de placa de múltiples pocillos e imágenes de inmunofluorescencia automatizadas para detectar y cuantificar la síntesis y distribución del ADNmt. Esto se puede utilizar aún más para investigar los efectos de varios inhibidores, tensiones celulares y silenciamiento génico en el metabolismo del ADNmt.
Abstract
La gran mayoría de los procesos celulares requieren un suministro continuo de energía, cuyo portador más común es la molécula de ATP. Las células eucariotas producen la mayor parte de su ATP en las mitocondrias por fosforilación oxidativa. Las mitocondrias son orgánulos únicos porque tienen su propio genoma que se replica y se transmite a la siguiente generación de células. En contraste con el genoma nuclear, hay múltiples copias del genoma mitocondrial en la célula. El estudio detallado de los mecanismos responsables de la replicación, reparación y mantenimiento del genoma mitocondrial es esencial para comprender el buen funcionamiento de las mitocondrias y las células enteras tanto en condiciones normales como de enfermedad. Aquí se presenta un método que permite la cuantificación de alto rendimiento de la síntesis y distribución de ADN mitocondrial (ADNmt) en células humanas cultivadas in vitro . Este enfoque se basa en la detección por inmunofluorescencia de moléculas de ADN sintetizadas activamente marcadas por la incorporación de 5-bromo-2′-desoxiuridina (BrdU) y la detección concurrente de todas las moléculas de ADNmt con anticuerpos antiADN. Además, las mitocondrias se visualizan con colorantes o anticuerpos específicos. El cultivo de células en un formato de múltiples pocillos y la utilización de un microscopio de fluorescencia automatizado facilitan el estudio de la dinámica del ADNmt y la morfología de las mitocondrias en una variedad de condiciones experimentales en un tiempo relativamente corto.
Introduction
Para la mayoría de las células eucariotas, las mitocondrias son orgánulos esenciales, ya que desempeñan un papel crucial en numerosos procesos celulares. En primer lugar, las mitocondrias son los principales proveedores de energía de las células1. Las mitocondrias también están involucradas en la regulación de la homeostasis celular (por ejemplo, redox2 intracelular y el balance de calcio3), la señalización celular 4,5, la apoptosis6, la síntesis de diferentes compuestos bioquímicos 7,8 y la respuesta inmune innata9. La disfunción mitocondrial está asociada a diversos estados patológicos y enfermedades humanas10.
El funcionamiento de las mitocondrias depende de la información genética localizada en dos genomas separados: el nuclear y el mitocondrial. El genoma mitocondrial codifica un pequeño número de genes en comparación con el genoma nuclear, pero todos los genes codificados por ADNmt son esenciales para la vida humana. La maquinaria de proteínas mitocondriales necesaria para mantener el ADNmt está codificada por el ADNn. Los componentes básicos del replisoma mitocondrial, así como algunos factores de biogénesis mitocondrial, ya han sido identificados (revisado en investigaciones anteriores11,12). Sin embargo, la replicación del ADN mitocondrial y los mecanismos de mantenimiento aún están lejos de ser entendidos. En contraste con el ADNn, el genoma mitocondrial existe en múltiples copias, lo que proporciona una capa adicional para regular la expresión génica mitocondrial. Actualmente se sabe mucho menos sobre la distribución y segregación del ADNmt dentro de los orgánulos, en qué medida estos procesos están regulados y, si lo están, qué proteínas están involucradas13. El patrón de segregación es crucial cuando las células contienen una población mixta de ADNmt mutado y de tipo salvaje. Su distribución desigual puede conducir a la generación de células con una cantidad perjudicial de ADNmt mutado.
Hasta ahora, los factores proteicos necesarios para el mantenimiento del ADNmt se han identificado principalmente mediante métodos bioquímicos, análisis bioinformáticos o mediante estudios asociados a enfermedades. En este trabajo, con el fin de garantizar una alta probabilidad de identificar factores que previamente han escapado a la identificación, se describe una estrategia diferente. El método se basa en el etiquetado del ADNmt durante la replicación o reparación con 5-bromo-2′-desoxiuridina (BrdU), un análogo nucleósido de la timidina. BrdU se incorpora fácilmente en las hebras de ADN nacientes durante la síntesis de ADN y, en general, se utiliza para monitorear la replicación del ADN nuclear14. Sin embargo, el procedimiento desarrollado aquí ha sido optimizado para detectar BrdU incorporado en el ADNmt utilizando la inmunofluorescencia de anticuerpos anti-BrdU.
El enfoque permite la cuantificación de alto rendimiento de la síntesis y distribución de ADNmt en células humanas cultivadas in vitro. Es necesaria una estrategia de alto rendimiento para realizar pruebas en diferentes condiciones experimentales en un tiempo relativamente corto; Por lo tanto, en el protocolo se propone utilizar un formato de pocillos múltiples para el cultivo celular y microscopía de fluorescencia automatizada para la obtención de imágenes. El protocolo incluye la transfección de células HeLa humanas con una biblioteca de ARNip y el posterior monitoreo de la replicación o reparación del ADNmt utilizando el etiquetado metabólico del ADN recién sintetizado con BrdU. Este enfoque se combina con la inmunotinción del ADN con la ayuda de anticuerpos anti-ADN. Ambos parámetros se analizan mediante microscopía de fluorescencia cuantitativa. Además, las mitocondrias se visualizan con un tinte específico. Para demostrar la especificidad del protocolo, se probó la tinción de BrdU en células desprovistas de ADNmt (células rho0), en células HeLa tras el silenciamiento de factores de mantenimiento de ADNmt bien conocidos y en células HeLa después del tratamiento con un inhibidor de la replicación del ADNmt. Los niveles de ADNmt también se midieron mediante un método independiente, a saber, qPCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Históricamente, el etiquetado de ADN por incorporación de BrdU y detección de anticuerpos se ha utilizado en la replicación del ADN nuclear y la investigación del ciclo celular 14,27,28. Hasta ahora, todos los protocolos para detectar ADN marcado con BrdU han incluido un paso de desnaturalización del ADN (ácido o térmico) o digestión enzimática (DNasa o proteinasa) para permitir la exposición al epítopo y facilitar l…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Centro Nacional de Ciencias, Polonia (Número de subvención / premio: 2018/31 / D / NZ2 / 03901).
Materials
| 2′,3′-Dideoxycytidine (ddC) | Sigma-Aldrich | D5782 | |
| 384 Well Cell Culture Microplates, black | Greiner Bio-One | #781946 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | B5002-1G | Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 µM BrdU solution for labeling. |
| Adhesive sealing film | Nerbe Plus | 04-095-0060 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21426 | |
| BioTek 405 LS microplate washer | Agilent | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Cell counting chamber Thoma | Heinz Herenz | REF:1080339 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Cytiva | SH30243.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 41965-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F1635 | Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323 | |
| IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody | Progen | #61014 | |
| LightCycler 480 System | Roche | ||
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | #13778150 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | Mitochondria tracking dye |
| Multidrop Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Orca-R2 (C10600) CCD Camera | Hamamatsu | ||
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100ML | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| qPCR primer Fw B2M (reference) | CAGGTACTCCAAAGATTCAGG | ||
| qPCR primer Fw GPI (reference gene) | GACCTTTACTACCCAGGAGA | ||
| qPCR primer Fw MT-ND1 | TAGCAGAGACCAACCGAACC | ||
| qPCR primer Fw POLG | TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC | ||
| qPCR primer Fw TFAM | GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT | ||
| qPCR primer Fw TWNK | GCCATGTGACACTGGTCATT | ||
| qPCR primer Rev B2M (reference) | GTCAACTTCAATGTCGGATGG | ||
| qPCR primer Rev GPI (reference gene) | AGTAGACAGGGCAACAAAGT | ||
| qPCR primer Rev MT-ND1 | ATGAAGAATAGGGCGAAGGG | ||
| qPCR primer Rev POLG | GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG | ||
| qPCR primer Rev TFAM | GGACTTCTGCCAGCATAATA | ||
| qPCR primer Rev TWNK | AACATTGTCTGCTTCCTGGC | ||
| ScanR microscope | Olympus | ||
| siRNA Ctrl | Dharmacon | D-001810-10-5 | |
| siRNA POLG | Invitrogen | POLGHSS108223 | |
| siRNA TFAM | Invitrogen | TFAMHSS144252 | |
| siRNA TWNK | Invitrogen | C10orf2HSS125597 | |
| Suction device | NeoLab | 2-9335 | Suction device for cell culture |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| Trypsin | Biowest | L0931-500 | |
| UPlanSApo 20x 0.75 NA objective | Olympus |
Referências
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