Billedbaseret kvantificering med høj kapacitet af mitokondrie-DNA-syntese og -distribution
Summary
En procedure til undersøgelse af dynamikken i mitokondrie-DNA (mtDNA) metabolisme i celler ved hjælp af et multi-well pladeformat og automatiseret immunfluorescensbilleddannelse til påvisning og kvantificering af mtDNA-syntese og distribution er beskrevet. Dette kan yderligere bruges til at undersøge virkningerne af forskellige hæmmere, cellulære spændinger og genhæmning på mtDNA-metabolisme.
Abstract
Langt de fleste cellulære processer kræver en kontinuerlig energiforsyning, hvis mest almindelige bærer er ATP-molekylet. Eukaryote celler producerer det meste af deres ATP i mitokondrierne ved oxidativ phosphorylering. Mitokondrier er unikke organeller, fordi de har deres eget genom, der replikeres og videregives til den næste generation af celler. I modsætning til det nukleare genom er der flere kopier af mitokondriegenomet i cellen. Den detaljerede undersøgelse af de mekanismer, der er ansvarlige for replikation, reparation og vedligeholdelse af mitokondriegenomet, er afgørende for at forstå, at mitokondrier og hele celler fungerer korrekt under både normale og sygdomsforhold. Her præsenteres en metode, der muliggør kvantificering af høj kapacitet af syntese og distribution af mitokondrie-DNA (mtDNA) i humane celler dyrket in vitro . Denne fremgangsmåde er baseret på immunofluorescensdetektion af aktivt syntetiserede DNA-molekyler mærket med 5-brom-2′-deoxyuridin (BrdU) inkorporering og samtidig påvisning af alle mtDNA-molekyler med anti-DNA-antistoffer. Derudover visualiseres mitokondrierne med specifikke farvestoffer eller antistoffer. Dyrkning af celler i et multibrøndformat og brugen af et automatiseret fluorescensmikroskop gør det lettere at studere dynamikken i mtDNA og mitokondriernes morfologi under forskellige eksperimentelle forhold på relativt kort tid.
Introduction
For de fleste eukaryote celler er mitokondrier essentielle organeller, da de spiller en afgørende rolle i mange cellulære processer. Først og fremmest er mitokondrier de vigtigste energileverandører af celler1. Mitokondrier er også involveret i regulering af cellulær homeostase (for eksempel intracellulær redox2 og calciumbalancen3), cellesignalering4,5, apoptose6, syntesen af forskellige biokemiske forbindelser 7,8 og det medfødte immunrespons9. Mitokondriel dysfunktion er forbundet med forskellige patologiske tilstande og menneskelige sygdomme10.
Mitokondriernes funktion afhænger af den genetiske information, der er placeret i to separate genomer: de nukleare og mitokondrie genomer. Mitokondriegenomet koder for et lille antal gener sammenlignet med det nukleare genom, men alle de mtDNA-kodede gener er afgørende for menneskelivet. Mitokondrieproteinmaskineriet, der er nødvendigt for at opretholde mtDNA’et, kodes af nDNA. De grundlæggende komponenter i mitokondrie-replisomet samt nogle mitokondriebiogenesefaktorer er allerede blevet identificeret (gennemgået i tidligere forskning11,12). Imidlertid er mitokondrie-DNA-replikations- og vedligeholdelsesmekanismer stadig langt fra at blive forstået. I modsætning til nDNA findes mitokondriegenomet i flere kopier, hvilket giver et ekstra lag til regulering af mitokondriel genekspression. Meget mindre er i øjeblikket kendt om fordelingen og adskillelsen af mtDNA inden for organeller, i hvilket omfang disse processer er reguleret, og hvis de er, hvilke proteiner der er involveret13. Segregeringsmønsteret er afgørende, når celler indeholder en blandet population af vildtype og muteret mtDNA. Deres ulige fordeling kan føre til generering af celler med en skadelig mængde muteret mtDNA.
Indtil videre er de proteinfaktorer, der er nødvendige for mtDNA-vedligeholdelse, hovedsageligt blevet identificeret ved biokemiske metoder, bioinformatiske analyser eller gennem sygdomsassocierede undersøgelser. I dette arbejde beskrives en anden strategi for at sikre en stor chance for at identificere faktorer, der tidligere har undgået identifikation. Metoden er baseret på mærkning af mtDNA under replikation eller reparation med 5-brom-2′-deoxyuridin (BrdU), en nukleosidanalog af thymidin. BrdU inkorporeres let i spirende DNA-strenge under DNA-syntese og bruges generelt til overvågning af replikationen af nukleært DNA14. Imidlertid er proceduren udviklet her optimeret til påvisning af BrdU inkorporeret i mtDNA ved hjælp af immunofluorescens af anti-BrdU-antistoffer.
Tilgangen giver mulighed for kvantificering af mtDNA-syntese og -distribution med høj kapacitet i humane celler dyrket in vitro. En strategi med høj kapacitet er nødvendig for at gennemføre test under forskellige eksperimentelle betingelser på relativt kort tid; Derfor foreslås det i protokollen at anvende et multibrøndformat til celledyrkning og automatiseret fluorescensmikroskopi til billeddannelse. Protokollen inkluderer transfektion af humane HeLa-celler med et siRNA-bibliotek og den efterfølgende overvågning af mtDNA-replikation eller reparation ved hjælp af metabolisk mærkning af nyligt syntetiseret DNA med BrdU. Denne fremgangsmåde kombineres med immunfarvning af DNA’et ved hjælp af anti-DNA-antistoffer. Begge parametre analyseres ved hjælp af kvantitativ fluorescensmikroskopi. Derudover visualiseres mitokondrier med et specifikt farvestof. For at demonstrere protokollens specificitet blev BrdU-farvning testet på celler uden mtDNA (rho0-celler), på HeLa-celler ved hæmning af velkendte mtDNA-vedligeholdelsesfaktorer og på HeLa-celler efter behandling med en mtDNA-replikationshæmmer. mtDNA-niveauerne blev også målt ved en uafhængig metode, nemlig qPCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Historisk set er DNA-mærkning ved BrdU-inkorporering og antistofdetektion blevet brugt i nuklear DNA-replikation og cellecyklusforskning 14,27,28. Indtil videre har alle protokoller til påvisning af BrdU-mærket DNA inkluderet et DNA-denatureringstrin (surt eller termisk) eller enzymfordøjelse (DNase eller proteinase) for at muliggøre epitopeksponering og lette antistofpenetration. Disse protokoller blev udviklet til tæt pa…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af det nationale videnskabscenter, Polen (tilskuds-/tildelingsnummer: 2018/31/D/NZ2/03901).
Materials
| 2′,3′-Dideoxycytidine (ddC) | Sigma-Aldrich | D5782 | |
| 384 Well Cell Culture Microplates, black | Greiner Bio-One | #781946 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | B5002-1G | Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 µM BrdU solution for labeling. |
| Adhesive sealing film | Nerbe Plus | 04-095-0060 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21426 | |
| BioTek 405 LS microplate washer | Agilent | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Cell counting chamber Thoma | Heinz Herenz | REF:1080339 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Cytiva | SH30243.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 41965-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F1635 | Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323 | |
| IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody | Progen | #61014 | |
| LightCycler 480 System | Roche | ||
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | #13778150 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | Mitochondria tracking dye |
| Multidrop Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Orca-R2 (C10600) CCD Camera | Hamamatsu | ||
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100ML | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| qPCR primer Fw B2M (reference) | CAGGTACTCCAAAGATTCAGG | ||
| qPCR primer Fw GPI (reference gene) | GACCTTTACTACCCAGGAGA | ||
| qPCR primer Fw MT-ND1 | TAGCAGAGACCAACCGAACC | ||
| qPCR primer Fw POLG | TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC | ||
| qPCR primer Fw TFAM | GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT | ||
| qPCR primer Fw TWNK | GCCATGTGACACTGGTCATT | ||
| qPCR primer Rev B2M (reference) | GTCAACTTCAATGTCGGATGG | ||
| qPCR primer Rev GPI (reference gene) | AGTAGACAGGGCAACAAAGT | ||
| qPCR primer Rev MT-ND1 | ATGAAGAATAGGGCGAAGGG | ||
| qPCR primer Rev POLG | GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG | ||
| qPCR primer Rev TFAM | GGACTTCTGCCAGCATAATA | ||
| qPCR primer Rev TWNK | AACATTGTCTGCTTCCTGGC | ||
| ScanR microscope | Olympus | ||
| siRNA Ctrl | Dharmacon | D-001810-10-5 | |
| siRNA POLG | Invitrogen | POLGHSS108223 | |
| siRNA TFAM | Invitrogen | TFAMHSS144252 | |
| siRNA TWNK | Invitrogen | C10orf2HSS125597 | |
| Suction device | NeoLab | 2-9335 | Suction device for cell culture |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| Trypsin | Biowest | L0931-500 | |
| UPlanSApo 20x 0.75 NA objective | Olympus |
Referências
- Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. The Biochemical Journal. 284, 1-13 (1992).
- Zhang, L., et al. Biochemical basis and metabolic interplay of redox regulation). Redox Biology. 26, 101284 (2019).
- Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. Mitochondrial Ca2+ homeostasis: Mechanism, role, and tissue specificities. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).
- Shadel, G. S., Horvath, T. L. Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis. Cell. 163 (3), 560-569 (2015).
- Martínez-Reyes, I., Chandel, N. S. Mitochondrial TCA cycle metabolites control physiology and disease. Nature Communications. 11 (1), 102 (2020).
- Galluzzi, L., Kepp, O., Trojel-Hansen, C., Kroemer, G. Mitochondrial control of cellular life, stress, and death. Circulation Research. 111 (9), 1198-1207 (2012).
- Rone, M. B., Fan, J., Papadopoulos, V. Cholesterol transport in steroid biosynthesis: role of protein-protein interactions and implications in disease states. Biochimica Et Biophysica Acta. 1791 (7), 646-658 (2009).
- Swenson, S. A., et al. From synthesis to utilization: The ins and outs of mitochondrial heme. Cells. 9 (3), 579 (2020).
- West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. Mitochondria in innate immune responses. Nature Reviews. Immunology. 11 (6), 389-402 (2011).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: In sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Pohjoismäki, J. L. O., Goffart, S. Of circles, forks and humanity: Topological organisation and replication of mammalian mitochondrial DNA. BioEssays. 33 (4), 290-299 (2011).
- Gustafsson, C. M., Falkenberg, M., Larsson, N. -. G. Maintenance and expression of mammalian mitochondrial DNA. Annual Review of Biochemistry. 85, 133-160 (2016).
- Nicholls, T. J., Gustafsson, C. M. Separating and segregating the human mitochondrial genome. Trends in Biochemical Sciences. 43 (11), 869-881 (2018).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
- Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: Improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).
- R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2021).
- . dplyr: A Grammar of Data Manipulation Available from: https://CRAN.R-project.org/package=dplyr (2021)
- . data.table: Extension of `data.frame Available from: https://CRAN.R-project.org/package=data.table (2020)
- . ggplot2: Elegant graphics for data analysis Available from: https://ggplot2.tidyverse.org (2016)
- . ggpubr: "ggplot2" based publication ready plots Available from: https://CRAN.R-project.org/package=ggpubr (2020)
- Hashiguchi, K., Zhang-Akiyama, Q. -. M. Establishment of human cell lines lacking mitochondrial DNA. Methods in Molecular Biology. 554, 383-391 (2009).
- Piechota, J., Szczesny, R., Wolanin, K., Chlebowski, A., Bartnik, E. Nuclear and mitochondrial genome responses in HeLa cells treated with inhibitors of mitochondrial DNA expression. Acta Biochimica Polonica. 53 (3), 485-495 (2006).
- Spelbrink, J. N., et al. Human mitochondrial DNA deletions associated with mutations in the gene encoding Twinkle, a phage T7 gene 4-like protein localized in mitochondria. Nature Genetics. 28 (3), 223-231 (2001).
- Campbell, C. T., Kolesar, J. E., Kaufman, B. A. Mitochondrial transcription factor A regulates mitochondrial transcription initiation, DNA packaging, and genome copy number. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 921-929 (2012).
- Krasich, R., Copeland, W. C. DNA polymerases in the mitochondria: A critical review of the evidence. Frontiers in Bioscience. 22 (4), 692-709 (2017).
- Kotrys, A. V., et al. Quantitative proteomics revealed C6orf203/MTRES1 as a factor preventing stress-induced transcription deficiency in human mitochondria. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7502-7517 (2019).
- Gratzner, H. G., Pollack, A., Ingram, D. J., Leif, R. C. Deoxyribonucleic acid replication in single cells and chromosomes by immunologic techniques. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 24 (1), 34-39 (1976).
- Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (1), 45-52 (2004).
- Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) biogenesis: visualization and duel incorporation of BrdU and EdU into newly synthesized mtDNA in vitro. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (2), 207-218 (2010).
- Liu, Y., et al. Multi-omic measurements of heterogeneity in HeLa cells across laboratories. Nature Biotechnology. 37 (3), 314-322 (2019).
