Laboratorieanalyser kan utnyttja prognostiskt värde från longitudinell optisk koherenstomografi (OCT) -baserad multimodal avbildning av åldersrelaterad makuladegeneration (AMD). Mänskliga donatorögon med och utan AMD avbildas med OCT, färg, nära infraröd reflektansskanning av laseroftalmoskopi och autofluorescens vid två excitationsvåglängder före vävnadssnittning.
En progressionssekvens för åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) inlärd från optisk koherenstomografi (OCT) -baserad multimodal (MMI) klinisk avbildning kan ge prognostiskt värde till laboratoriefynd. I detta arbete applicerades ex vivo OCT och MMI på mänskliga donatorögon före snittning av näthinnans vävnad. Ögonen återfanns från icke-diabetiska vita donatorer i åldern ≥80 år, med en döds-till-konserveringstid (DtoP) på ≤6 timmar. Globerna återfanns på plats, skårades med en 18 mm trefin för att underlätta borttagning av hornhinnan och nedsänktes i buffrad 4% paraformaldehyd. Färgfundusbilder förvärvades efter borttagning av främre segment med ett dissekeringsomfång och en SLR-kamera med trans-, epi- och blixtbelysning vid tre förstoringar. Globerna placerades i en buffert i en specialdesignad kammare med en 60 dioptrilins. De avbildades med spektraldomän OCT (30 ° makula kub, 30 μm avstånd, medelvärde = 25), nära infraröd reflektans, 488 nm autofluorescens och 787 nm autofluorescens. AMD-ögonen visade en förändring i retinalt pigmentepitel (RPE), med drusen eller subretinal drusenoidavlagringar (SDD), med eller utan neovaskularisering och utan tecken på andra orsaker. Mellan juni 2016 och september 2017 återfanns 94 högra ögon och 90 vänstra ögon (DtoP: 3,9 ± 1,0 timmar). Av de 184 ögonen hade 40,2% AMD, inklusive tidig mellanliggande (22,8%), atrofisk (7,6%) och neovaskulär (9,8%) AMD och 39,7% hade obemärkta makulas. Drusen, SDD, hyperreflekterande foci, atrofi och fibrovaskulära ärr identifierades med hjälp av OCT. Artefakter inkluderade vävnadsopacifiering, avlossningar (bacillär, retinal, RPE, koroidal), foveal cystisk förändring, en böljande RPE och mekanisk skada. För att vägleda kryosnittningen användes OCT-volymer för att hitta fovea och optiska nervhuvudmärken och specifika patologier. Ex vivo-volymerna registrerades med in vivo-volymerna genom att välja referensfunktionen för eyetracking. Patologins synlighet ex vivo som ses in vivo beror på bevarandekvaliteten. Inom 16 månader återfanns 75 snabba DtoP-donatorögon i alla stadier av AMD och iscensattes med kliniska MMI-metoder.
Femton års hantering av neovaskulär åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) med anti-VEGF-terapi under ledning av optisk koherenstomografi (OCT) har gett nya insikter i progressionssekvensen och mikroarkitekturen för denna vanliga orsak till synförlust. Ett viktigt erkännande är att AMD är en tredimensionell sjukdom som involverar den neurosensoriska näthinnan, retinalt pigmentepitel (RPE) och koroid. Som ett resultat av OCT-avbildning av försökspatienter och andra ögon hos behandlade klinikpatienter erkänns nu patologins egenskaper utöver de som ses av färgfundusfotografering, en klinisk standard i årtionden. Dessa inkluderar intraretinal neovaskularisering (typ 3 makulär neovaskularisering1, tidigare angiomatös proliferation), subretinala drusenoidavlagringar (SDD, även kallad retikulär pseudodrusen)2, flera vägar för RPE-öde3,4 och intensivt gliotiska Müller-celler i atrofi 5,6.
Modellsystem som saknar makulor (celler och djur) återskapar några skivor av denna komplexa sjukdom 7,8,9. Ytterligare framgång med att förbättra AMD: s börda kan komma från upptäckten och utforskningen av primär patologi i mänskliga ögon, förstå den unika cellulära sammansättningen av makula, följt av översättning till modellsystem. Denna rapport skildrar ett tre decennium av samarbete mellan ett akademiskt forskningslaboratorium och en ögonbank. Målen med de vävnadskarakteriseringsmetoder som beskrivs här är tvåfaldiga: 1) att informera utvecklande diagnostisk teknik genom att demonstrera grunden för fundusutseende och bildsignalkällor med mikroskopi, och 2) att klassificera AMD-prover för riktade (immunohistokemi) och oriktade molekylära upptäcktstekniker (avbildande masspektrometri, IMS och rumslig transkriptomik) som bevarar kon-bara fovea och stavrika para- och perifovea. Sådana studier kan påskynda översättningen till klinisk OCT, för vilken en progressionssekvens och longitudinell uppföljning är möjlig genom ögonspårning. Denna teknik, som är utformad för att övervaka behandlingseffekter, registrerar skanningar från ett klinikbesök till nästa med hjälp av retinala kärl. Att koppla ögonspårad OCT till laboratorieresultat erhållna med destruktiva tekniker kan ge en ny nivå av prognostiskt värde för molekylära fynd.
År 1993 fångade forskningslaboratoriet färgfotografier av postmortem fundus på film10. Denna ansträngning inspirerades av den fantastiska fotomikroskopin och histologin hos den mänskliga perifera näthinnan av Foos och kollegor 11,12,13 och de omfattande AMD-klinopitopatologiska korrelationerna av Sarks et al.14,15. Från och med 2009 antogs ex vivo multimodal imaging (MMI) förankrad på spektraldomän OCT. Denna övergång inspirerades av liknande ansträngningar från andra 16,17 och särskilt av insikten att så mycket av den ultrastruktur som beskrivs av Sarks var tillgänglig i tre dimensioner, över tiden, i kliniken 18,19. Målet var att förvärva ögon med bifogade makulor inom en rimlig tidsram för väldrivna studier av fenotyper på cellulär nivå i näthinnan, RPE och choroid. Avsikten var att gå bortom “per öga” -statistik till “per lesionstyp”, en standard som påverkas av “sårbara plack” -koncepten från hjärt-kärlsjukdom20,21.
Protokollet i denna rapport återspeglar erfarenheter med nästan 400 par donatorögon anslutna i flera strömmar. Under 2011-2014 skapades Project MACULA-webbplatsen för AMD-histopatologi, som innehåller skikttjocklekar och anteckningar från 142 arkiverade exemplar. Dessa ögon bevarades från 1996-2012 i ett glutaraldehyd-paraformaldehydfixeringsmedel för högupplöst epoxihartshistologi och elektronmikroskopi. Alla fundi hade fotograferats i färg när de mottogs och reimagedes av OCT strax före histologi. En ögonhållare som ursprungligen utformades för optiska nervstudier22 användes för att rymma en 8 mm diameter fulltjocklek vävnadstans centrerad på fovea. OCT B-skanningar genom fovealcentret och en plats 2 mm överlägsen, motsvarande histologi på samma nivåer, laddades upp på webbplatsen, plus ett färgfundusfotografi. Valet av OCT-planen dikterades av AMD-patologins framträdande under fovea23 och framträdandet av SDD i stavrika områden överlägsna fovea24,25.
Från och med 2013 var ögon avbildade med OCT-förankrad MMI under livet tillgängliga för direkta kliniskopatologiska korrelationer. De flesta (7 av 10 donatorer) involverade patienter vid en retina-remisspraxis (författare: K.B.F.), som erbjöd ett avancerat direktivregister för patienter som var intresserade av att donera sina ögon efter döden för forskningsändamål. Ögonen återfanns och bevarades av den lokala ögonbanken, överfördes till laboratoriet och förbereddes på samma sätt som Project MACULA-ögonen. Pre-mortem kliniska OCT-volymer lästes sömlöst i laboratoriet, vilket anpassade de patologiska egenskaperna som ses under livet med de funktioner som ses under mikroskopet26.
Från och med 2014 började prospektiv ögoninsamling genom screening för AMD i donatorögon utan klinisk historia men bevarad under en definierad tidsgräns (6 timmar). För detta ändamål modifierades ögonhållaren för att rymma en hel jordklot. Detta minskade risken för lossning runt de skurna kanterna på den tidigare använda 8 mm stansen. Ögonen bevarades i 4% buffrad paraformaldehyd för immunhistokemi och överfördes till 1% nästa dag för långtidsförvaring. Under 2016-2017 (före pandemin) återhämtades 184 ögon från 90 givare. Statistiken och bilderna i denna rapport genereras från denna serie. Under pandemitiden (2020 lockdowns och efterdyningar) fortsatte prospektiva samlingar för transkriptomik och IMS-samarbeten i minskad takt, i huvudsak med 2014-metoderna.
Andra metoder för bedömning av donatorögon finns tillgängliga. Minnesota Grading System (MGS)27,28 är baserat på AREDS kliniska system för färgfundusfotografering 29. Begränsningarna av denna metod innefattar kombinationen av atrofisk och neovaskulär AMD i ett stadium av “sen AMD”. Vidare innebär MGS avlägsnande av den neurosensoriska näthinnan före fotodokumentationen av RPE-koroid. Detta steg avlägsnar SDD i varierande grad30,31 och tar bort den yttre näthinnans rumsliga korrespondens och dess stödsystem. Således kan ansträngningar att koppla metabolisk efterfrågan och signalering från näthinnan till patologi i RPE-choroid hindras. Utah-systemet implementerade MMI med ex vivo-färgfotografering och OCT för att kategorisera ögon avsedda för dissektion i regioner för RNA- och proteinextraktioner32. Även om det är att föredra framför extraktioner av hela ögonmusslor, representerar området med 3 mm diameter med högsta risk för AMD-progression33,34 endast 25% av en 6 mm diameter fovea-centrerad stans. Således är tekniker som kan lokalisera fynd med hänvisning till fovea, såsom seriesnittning för immunhistokemi, fördelaktiga.
Med hjälp av en populationsbaserad screeningmetod under en 16-månadersperiod före COVID-eran var det möjligt att skaffa 75 donatorögon med AMD. Alla återfanns med en kort DtoP och iscensattes med OCT-förankrad MMI. Ålderskriteriet (>80 år) ligger utanför det typiska åldersintervallet för vävnadsåtervinning avsedd för transplanterbara hornhinnor. Trots den höga åldern resulterade våra kriterier i ögon i alla stadier av AMD. Många RPE-fenotyper är gemensamma för alla AMD-stadier, och vissa är exklusi…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Heidelberg Engineering för instrumenteringen och utformningen av den ursprungliga ögonhållaren, Richard F. Spaide MD för introduktionen till OCT-baserad multimodal avbildning, Christopher Girkin MD för att underlätta tillgången till kliniska bildenheter och David Fisher för figur 1. Återhämtningen av de mänskliga donatorögonen för forskning stöddes av National Institutes of Health (NIH) bidrag R01EY06019 (CAC), P30 EY003039 (Pittler), R01EY015520 (Smith), R01EY027948 (CAC, TA) R01EY030192 (Li), R01EY031209 (Stambolian) och U54EY032442 (Spraggins), IZKF Würzburg (N-304, T.A.), EyeSight Foundation of Alabama, International Retinal Research Foundation (C.A.C.), Arnold och Mabel Beckman Initiative for Macular Research (CAC) och Research to Prevent Blindness AMD Catalyst (Schey).
Beakers, 250 mL | Fisher | # 02-540K | |
Bottles, 1 L, Pyrex | Fisher | # 10-462-719 | storage for preservative |
Bunsen burner or heat source | Eisco | # 17-12-818 | To melt wax |
Camera, digital | Nikon D7200 | D7200 | |
Computer and storage | Apple | iMac Pro; 14 TB external hard drive | Image storage |
Container, insulated | Fisher | # 02-591-45 | For wet ice |
Containers, 2 per donor, 40 mL | Fisher | Sameco Bio-Tite 40 mL # 13-711-86 | For preservative |
Crucible, quartz 30 mL | Fisher | # 08-072D | Hold globe for photography |
Cylinder, graduate, 250 mL | Fisher | # 08-549G | |
Disinfectant cleaning supplies | https://www.cardinalhealth.com/en/product-solutions/medical/infection-control/antiseptics.html | ||
Eye holder with lens and mounting bracket | contact J. Messinger | jeffreymessinger@uabmc.edu | custom modification of Heidelberg Engineering original design |
Face Protection Masks | Fisher | # 19-910-667 | |
Forceps, Harmon Fix | Roboz | # RS-8247 | |
Forceps, Micro Adson | Roboz | # RS-5232 | |
Forceps, Tissue | Roboz | # RS-5172 | |
Glass petri dish, Kimax | Fisher | # 23064 | |
Gloves Diamond Grip | Fisher | # MF-300 | |
Gowns GenPro | Fisher | # 19-166-116 | |
Image editing software | Adobe | Photoshop 2021, Creative Suite | |
KimWipes | Fisher | # 06-666 | |
Lamps, 3 goosenecks | Schott Imaging | # A20800 | |
Microscope, stereo | Nikon | SMZ 1000 | for dissection |
Microscope, stereo | Olympus | SZX9 | color fundus photography |
Paraformaldehyde, 20% | EMS | # 15713-S | for preservative; dilute for storage |
pH meter | Fisher | # 01-913-806 | |
Phosphate buffer, Sorenson’s, 0.2 M pH 7.2 | EMS | # 11600-10 | |
Ring flash | B & H Photo Video | Sigma EM-140 DG | |
Ruby bead, 1 mm diameter | Meller Optics | # MRB10MD | |
Safety Glasses 3M | Fisher | # 19-070-940 | |
Scanning laser ophthalmoscope | Heidelberg Engineering | HRA2 | |
Scissors, curved spring | Roboz | # RS-5681 | |
Sharps container | Fisher | # 1482763 | |
Shutter cord, remote | Nikon | MC-DC2 | |
Spectral Domain OCT device | Heidelberg Engineering | Spectralis HRA&OCT | https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf |
Stainless steel ball bearing, 25.4 mm diameter | McMaster-Carr | # 9529K31 | |
Tissue marking dye, black | Cancer Diagnostics Inc | # 0727-1 | |
Tissue slicer blades | Thomas Scientific | # 6767C18 | |
Trephine, 18-mm diameter | Stratis Healthcare | # 6718L | |
TV monitor (HDMI) and cord for digital camera | B&H Photo Video | BH # COHD18G6PROB | for live viewing and remote camera display features |
Wax, pink dental | EMS | # 72670 | |
Wooden applicators | Puritan | # 807-12 |