Eks Vivo OCT-basert multimodal avbildning av menneskelige donorøyne for forskning på aldersrelatert makuladegenerasjon

Summary

Laboratorieanalyser kan utnytte prognostisk verdi fra den langsgående optiske koherenstomografien (OCT) -basert multimodal avbildning av aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD). Menneskelige donorøyne med og uten AMD avbildes ved hjelp av OCT, farge, nær-infrarød refleksjonsskanning, laseroftalmoskopi og autofluorescens ved to eksitasjonsbølgelengder før vevsseksjonering.

Abstract

En progresjonssekvens for aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD) lært fra optisk koherenstomografi (OCT) -basert multimodal (MMI) klinisk bildebehandling kan legge til prognostisk verdi for laboratoriefunn. I dette arbeidet ble ex vivo OCT og MMI påført humane donorøyne før retinal vevsseksjonering. Øynene ble gjenfunnet fra ikke-diabetiske hvite donorer i alderen ≥80 år, med en død-til-bevaringstid (DtoP) på ≤6 timer. Kulene ble gjenfunnet på stedet, skåret med en 18 mm trefin for å lette fjerning av hornhinnen, og nedsenket i bufret 4% paraformaldehyd. Fargefundusbilder ble anskaffet etter fjerning av fremre segment med dissekeringsomfang og et speilreflekskamera med trans-, epi- og blitsbelysning ved tre forstørrelser. Globusene ble plassert i en buffer i et spesialdesignet kammer med en 60 diopterlinse. De ble avbildet med spektraldomenet OCT (30° makula-kube, 30 μm avstand, gjennomsnitt = 25), nær-infrarød refleksjon, 488 nm autofluorescens og 787 nm autofluorescens. AMD-øynene viste en forandring i retinalpigmentepitelet (RPE), med drusen eller subretinale drusenoidavleiringer (SDD), med eller uten neovaskularisering, og uten tegn på andre årsaker. Mellom juni 2016 og september 2017 ble 94 høyre øyne og 90 venstre øyne gjenfunnet (DtoP: 3,9 ± 1,0 timer). Av de 184 øynene hadde 40,2% AMD, inkludert tidlig mellomliggende (22,8%), atrofisk (7,6%) og neovaskulær (9,8%) AMD, og 39,7% hadde unremarkable makulaer. Drusen, SDD, hyperreflekterende foci, atrofi og fibrovaskulære arr ble identifisert ved hjelp av OCT. Artefakter inkluderte vevsopasifisering, løsrivelser (bacillary, retinal, RPE, choroidal), foveal cystisk forandring, en bølgende RPE og mekanisk skade. For å veilede kryoseksjoneringen ble OCT-volumer brukt til å finne fovea og synsnervehodelandemerker og spesifikke patologier. Ex vivo-volumene ble registrert med in vivo-volumene ved å velge referansefunksjon for øyesporing. Ex vivo-synligheten av patologien sett in vivo avhenger av bevaringskvaliteten. Innen 16 måneder ble 75 raske DtoP-donorøyne i alle stadier av AMD gjenvunnet og iscenesatt ved hjelp av kliniske MMI-metoder.

Introduction

Femten år med å håndtere neovaskulær aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD) med anti-VEGF-terapi under veiledning av optisk koherenstomografi (OCT) har gitt ny innsikt i progresjonssekvensen og mikroarkitekturen til denne utbredte årsaken til synstap. En viktig anerkjennelse er at AMD er en tredimensjonal sykdom som involverer nevrosensorisk retina, retinal pigmentepitel (RPE) og choroid. Som et resultat av OCT-avbildning av forsøkspasienter og medøynene til behandlede klinikkpasienter, er funksjonene i patologi utover de som ses av fargefundusfotografering, en klinisk standard i flere tiår, nå anerkjent. Disse inkluderer intraretinal neovaskularisering (type 3 makulærneovaskularisering¹, tidligere angiomatøs proliferasjon), subretinale drusenoidavleiringer (SDDs, også kalt retikulære pseudodrusen)², multiple veier av RPE-skjebne^3,4 og intenst gliotiske Müller-celler i atrofi ^5,6.

Modellsystemer som mangler makulaer (celler og dyr) gjenskaper noen skiver av denne komplekse sykdommen ^7,8,9. Ytterligere suksess i å forbedre byrden av AMD kan komme fra oppdagelsen og utforskningen av primær patologi i menneskelige øyne, forstå den unike cellulære sammensetningen av makulaen, etterfulgt av oversettelse til modellsystemer. Denne rapporten skildrer et tre tiår langt samarbeid mellom et akademisk forskningslaboratorium og en øyebank. Målene med vevskarakteriseringsmetodene beskrevet her er todelt: 1) å informere utviklende diagnostisk teknologi ved å demonstrere grunnlaget for fundusutseende og bildesignalkilder med mikroskopi, og 2) å klassifisere AMD-prøver for målrettede (immunhistokjemi) og ikke-målrettede molekylære oppdagelsesteknikker (avbildningsmassespektrometri, IMS og romlig transkriptomikk) som bevarer kjeglefovea og stavrike para- og perifovea. Slike studier kan akselerere oversettelsen til klinisk OCT, der en progresjonssekvens og longitudinell oppfølging er mulig gjennom øyesporing. Denne teknologien, som er designet for å overvåke behandlingseffekter, registrerer skanninger fra ett klinikkbesøk til det neste ved hjelp av netthinnekar. Kobling av øyesporet OCT til laboratorieresultater oppnådd med destruktive teknikker kan gi et nytt nivå av prognostisk verdi for molekylære funn.

I 1993 tok forskningslaboratoriet fargefotografier av post mortem fundus på film¹⁰. Denne innsatsen ble inspirert av den ypperlige fotomikroskopien og histologien til den humane perifere netthinnen av Foos og kolleger 11,12,13 og de omfattende AMD kliniskpatologiske korrelasjonene av Sarks et ^al.14,15. Fra og med 2009 ble ex vivo multimodal imaging (MMI) forankret på spektraldomenet OCT vedtatt. Denne overgangen ble inspirert av den samme innsatsen til andre 16,17 og spesielt av erkjennelsen av at så mye av ultrastrukturen beskrevet av Sarks var tilgjengelig i tre dimensjoner, over tid, i klinikken ^18,19. Målet var å skaffe øyne med tilhørende makulaer i en rimelig tidsramme for veldrevne studier av fenotyper på cellenivå i netthinnen, RPE og årehinnen. Hensikten var å gå utover “per øye” -statistikk til “per lesjonstype”, en standard påvirket av “sårbar plakk” -konseptene fra kardiovaskulær sykdom^20,21.

Protokollen i denne rapporten gjenspeiler erfaringer med nesten 400 par donorøyne i flere bekker. I 2011-2014 ble Project MACULA-nettstedet til AMD-histopatologi opprettet, som inkluderer lagtykkelser og merknader fra 142 arkiverte prøver. Disse øynene ble bevart fra 1996-2012 i et glutaraldehyd-paraformaldehydfikseringsmiddel for høyoppløselig epoksyharpikshistologi og elektronmikroskopi. Alle fundi hadde blitt fotografert i farger da de ble mottatt og ble reimaged av OCT like før histologi. En øyeholder opprinnelig designet for optiske nervestudier²² ble brukt til å imøtekomme en 8 mm diameter i full tykkelse vevstans sentrert på fovea. OCT B-skanninger gjennom fovealsenteret og et område 2 mm superior, tilsvarende histologi på samme nivå, ble lastet opp til nettstedet, pluss et fargefundusfotografi. Valget av OCT-flyene ble diktert av fremtredenen av AMD-patologi under fovea²³ og fremtredenen av SDDer i stavrike områder overlegen fovea^24,25.

Fra og med 2013 var øyne avbildet med OCT-forankret MMI i løpet av livet tilgjengelige for direkte kliniskpatologiske korrelasjoner. De fleste (7 av 10 givere) involverte pasienter ved en retina-henvisningspraksis (forfatter: KBF), som tilbød et avansert direktivregister for pasienter som var interessert i å donere øynene etter døden til forskningsformål. Øynene ble gjenfunnet og bevart av den lokale øyebanken, overført til laboratoriet og tilberedt på samme måte som Project MACULA-øynene. Pre-mortem kliniske OCT-volumer ble sømløst lest i laboratoriet, og justerte dermed patologiske trekk sett i løpet av livet med funksjonene sett under mikroskopet²⁶.

Fra og med 2014 begynte prospektiv øyeinnsamling ved screening for AMD i donorøyne uten klinisk historie, men bevart under en definert tidsbegrensning (6 timer). Til dette formål ble øyeholderen modifisert for å imøtekomme en hel klode. Dette reduserte sjansen for løsrivelse rundt kuttkantene på den tidligere brukte 8 mm stansen. Øynene ble bevart i 4% bufret paraformaldehyd for immunhistokjemi og overført til 1% neste dag for langtidslagring. I 2016-2017 (før pandemien) ble 184 øyne fra 90 givere gjenopprettet. Statistikken og bildene i denne rapporten er hentet fra denne serien. Under pandemitiden (2020 lockdowns og aftermath) fortsatte potensielle samlinger for transkriptomikk og IMS-samarbeid i redusert tempo, hovedsakelig ved hjelp av 2014-metodene.

Andre metoder for donor øye vurdering er tilgjengelige. Minnesota Grading System (MGS)^27,28 er basert på AREDS kliniske system for fargefundusfotografering ²⁹. Begrensningene i denne metoden inkluderer kombinasjonen av atrofisk og neovaskulær AMD i ett stadium av “sen AMD”. Videre innebærer MGS fjerning av nevrosensorisk retina før fotodokumentasjonen av RPE-choroid. Dette trinnet fjerner SDD-er i varierende grad^30,31 og fjerner den romlige korrespondansen til den ytre netthinnen og dens støttesystem. Dermed kan forsøk på å knytte metabolsk etterspørsel og signalering fra netthinnen til patologi i RPE-choroid hindres. Utah-systemet implementerte MMI ved hjelp av ex vivo fargefotografering og OCT for å kategorisere øyne bestemt for disseksjon i regioner for RNA og proteinekstraksjoner³². Selv om det er å foretrekke fremfor hele øyekoppekstraksjoner, representerer 3 mm diameterområdet med høyest risiko for AMD-progresjon^33,34 bare 25% av en 6 mm diameter fovea-sentrert slag. Dermed er teknikker som kan lokalisere funn i referanse til fovea, for eksempel seriesnitting for immunhistokjemi, fordelaktige.

Protocol

Det institusjonelle gjennomgangsstyret ved University of Alabama i Birmingham godkjente laboratoriestudiene, som fulgte god laboratoriepraksis og biosikkerhetsnivå 2/2+. Alle amerikanske øyebanker overholder 2006 Uniform Anatomical Gifts Act og US Food and Drug Administration. De fleste amerikanske øyebanker, inkludert Advancing Sight Network, overholder de medisinske standardene til Eye Bank Association of America. Materialfortegnelsen viser forsyninger og utstyr. …

Representative Results

Tabell 1 viser at i løpet av 2016-2017 ble 184 øyne fra 94 hvite ikke-diabetiske donorer >80 år gjenfunnet. Gjennomsnittlig død-til-bevaringstid var 3,9 timer (område: 2,0-6,4 timer). Av de 184 øynene som ble gjennomgått, hadde 75 (40,2%) visse AMD. Følgende kategorier ble identifisert: Unremarkable (39,7%), Tvilsom (11,4%), Early-Intermediate AMD (22,8%), Atrofisk (7,6%), Neovaskulær (9,8%), Annet (8,7%) og Ukjent/Ikke registrert/Ikke graderbart (<1%). Figur 2, fig…

Discussion

Ved å bruke en populasjonsbasert screeningtilnærming i løpet av en 16 måneders periode i pre-COVID-tiden, var det mulig å skaffe 75 donorøyne med AMD. Alle ble gjenfunnet med en kort DtoP og iscenesatt ved hjelp av OCT-forankret MMI. Alderskriteriet (>80 år) ligger utenfor det typiske aldersspennet for vevsgjenvinning beregnet på transplanterbare hornhinner. Til tross for den høye alderen resulterte kriteriene våre i øyne i alle stadier av AMD. Mange RPE-fenotyper er felles for alle AMD-stadier, og noen er eks…

Materials

Beakers, 250 mL	Fisher	# 02-540K
Bottles, 1 L, Pyrex	Fisher	# 10-462-719	storage for preservative
Bunsen burner or heat source	Eisco	# 17-12-818	To melt wax
Camera, digital	Nikon D7200	D7200
Computer and storage	Apple	iMac Pro; 14 TB external hard drive	Image storage
Container, insulated	Fisher	# 02-591-45	For wet ice
Containers, 2 per donor, 40 mL	Fisher	Sameco Bio-Tite  40 mL # 13-711-86	For preservative
Crucible, quartz 30 mL	Fisher	# 08-072D	Hold globe for photography
Cylinder, graduate, 250 mL	Fisher	# 08-549G
Disinfectant cleaning supplies			https://www.cardinalhealth.com/en/product-solutions/medical/infection-control/antiseptics.html
Eye holder with lens and mounting bracket	contact J. Messinger	jeffreymessinger@uabmc.edu	custom modification of Heidelberg Engineering original design
Face Protection Masks	Fisher	# 19-910-667
Forceps, Harmon Fix	Roboz	# RS-8247
Forceps, Micro Adson	Roboz	# RS-5232
Forceps, Tissue	Roboz	# RS-5172
Glass petri dish, Kimax	Fisher	# 23064
Gloves Diamond Grip	Fisher	# MF-300
Gowns GenPro	Fisher	# 19-166-116
Image editing software	Adobe	Photoshop 2021, Creative Suite
KimWipes	Fisher	# 06-666
Lamps, 3 goosenecks	Schott Imaging	# A20800
Microscope, stereo	Nikon	SMZ 1000	for dissection
Microscope, stereo	Olympus	SZX9	color fundus photography
Paraformaldehyde, 20%	EMS	# 15713-S	for preservative; dilute for storage
pH meter	Fisher	# 01-913-806
Phosphate buffer, Sorenson’s, 0.2 M pH 7.2	EMS	# 11600-10
Ring flash	B & H Photo Video	Sigma EM-140 DG
Ruby bead, 1 mm diameter	Meller Optics	# MRB10MD
Safety Glasses 3M	Fisher	# 19-070-940
Scanning laser ophthalmoscope	Heidelberg Engineering	HRA2
Scissors, curved spring	Roboz	# RS-5681
Sharps container	Fisher	# 1482763
Shutter cord, remote	Nikon	MC-DC2
Spectral Domain OCT device	Heidelberg Engineering	Spectralis HRA&OCT	https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf
Stainless steel ball bearing, 25.4 mm diameter	McMaster-Carr	# 9529K31
Tissue marking dye, black	Cancer Diagnostics Inc	# 0727-1
Tissue slicer blades	Thomas Scientific	# 6767C18
Trephine, 18-mm diameter	Stratis Healthcare	# 6718L
TV monitor (HDMI) and cord for digital camera	B&H Photo Video	BH # COHD18G6PROB	for live viewing and remote camera display features
Wax, pink dental	EMS	# 72670
Wooden applicators	Puritan	# 807-12