Ex Vivo OCT-baserad multimodal avbildning av mänskliga donatorögon för forskning om åldersrelaterad makuladegeneration

Summary

Laboratorieanalyser kan utnyttja prognostiskt värde från longitudinell optisk koherenstomografi (OCT) -baserad multimodal avbildning av åldersrelaterad makuladegeneration (AMD). Mänskliga donatorögon med och utan AMD avbildas med OCT, färg, nära infraröd reflektansskanning av laseroftalmoskopi och autofluorescens vid två excitationsvåglängder före vävnadssnittning.

Abstract

En progressionssekvens för åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) inlärd från optisk koherenstomografi (OCT) -baserad multimodal (MMI) klinisk avbildning kan ge prognostiskt värde till laboratoriefynd. I detta arbete applicerades ex vivo OCT och MMI på mänskliga donatorögon före snittning av näthinnans vävnad. Ögonen återfanns från icke-diabetiska vita donatorer i åldern ≥80 år, med en döds-till-konserveringstid (DtoP) på ≤6 timmar. Globerna återfanns på plats, skårades med en 18 mm trefin för att underlätta borttagning av hornhinnan och nedsänktes i buffrad 4% paraformaldehyd. Färgfundusbilder förvärvades efter borttagning av främre segment med ett dissekeringsomfång och en SLR-kamera med trans-, epi- och blixtbelysning vid tre förstoringar. Globerna placerades i en buffert i en specialdesignad kammare med en 60 dioptrilins. De avbildades med spektraldomän OCT (30 ° makula kub, 30 μm avstånd, medelvärde = 25), nära infraröd reflektans, 488 nm autofluorescens och 787 nm autofluorescens. AMD-ögonen visade en förändring i retinalt pigmentepitel (RPE), med drusen eller subretinal drusenoidavlagringar (SDD), med eller utan neovaskularisering och utan tecken på andra orsaker. Mellan juni 2016 och september 2017 återfanns 94 högra ögon och 90 vänstra ögon (DtoP: 3,9 ± 1,0 timmar). Av de 184 ögonen hade 40,2% AMD, inklusive tidig mellanliggande (22,8%), atrofisk (7,6%) och neovaskulär (9,8%) AMD och 39,7% hade obemärkta makulas. Drusen, SDD, hyperreflekterande foci, atrofi och fibrovaskulära ärr identifierades med hjälp av OCT. Artefakter inkluderade vävnadsopacifiering, avlossningar (bacillär, retinal, RPE, koroidal), foveal cystisk förändring, en böljande RPE och mekanisk skada. För att vägleda kryosnittningen användes OCT-volymer för att hitta fovea och optiska nervhuvudmärken och specifika patologier. Ex vivo-volymerna registrerades med in vivo-volymerna genom att välja referensfunktionen för eyetracking. Patologins synlighet ex vivo som ses in vivo beror på bevarandekvaliteten. Inom 16 månader återfanns 75 snabba DtoP-donatorögon i alla stadier av AMD och iscensattes med kliniska MMI-metoder.

Introduction

Femton års hantering av neovaskulär åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) med anti-VEGF-terapi under ledning av optisk koherenstomografi (OCT) har gett nya insikter i progressionssekvensen och mikroarkitekturen för denna vanliga orsak till synförlust. Ett viktigt erkännande är att AMD är en tredimensionell sjukdom som involverar den neurosensoriska näthinnan, retinalt pigmentepitel (RPE) och koroid. Som ett resultat av OCT-avbildning av försökspatienter och andra ögon hos behandlade klinikpatienter erkänns nu patologins egenskaper utöver de som ses av färgfundusfotografering, en klinisk standard i årtionden. Dessa inkluderar intraretinal neovaskularisering (typ 3 makulär neovaskularisering¹, tidigare angiomatös proliferation), subretinala drusenoidavlagringar (SDD, även kallad retikulär pseudodrusen)², flera vägar för RPE-öde^3,4 och intensivt gliotiska Müller-celler i atrofi ^5,6.

Modellsystem som saknar makulor (celler och djur) återskapar några skivor av denna komplexa sjukdom ^7,8,9. Ytterligare framgång med att förbättra AMD: s börda kan komma från upptäckten och utforskningen av primär patologi i mänskliga ögon, förstå den unika cellulära sammansättningen av makula, följt av översättning till modellsystem. Denna rapport skildrar ett tre decennium av samarbete mellan ett akademiskt forskningslaboratorium och en ögonbank. Målen med de vävnadskarakteriseringsmetoder som beskrivs här är tvåfaldiga: 1) att informera utvecklande diagnostisk teknik genom att demonstrera grunden för fundusutseende och bildsignalkällor med mikroskopi, och 2) att klassificera AMD-prover för riktade (immunohistokemi) och oriktade molekylära upptäcktstekniker (avbildande masspektrometri, IMS och rumslig transkriptomik) som bevarar kon-bara fovea och stavrika para- och perifovea. Sådana studier kan påskynda översättningen till klinisk OCT, för vilken en progressionssekvens och longitudinell uppföljning är möjlig genom ögonspårning. Denna teknik, som är utformad för att övervaka behandlingseffekter, registrerar skanningar från ett klinikbesök till nästa med hjälp av retinala kärl. Att koppla ögonspårad OCT till laboratorieresultat erhållna med destruktiva tekniker kan ge en ny nivå av prognostiskt värde för molekylära fynd.

År 1993 fångade forskningslaboratoriet färgfotografier av postmortem fundus på film¹⁰. Denna ansträngning inspirerades av den fantastiska fotomikroskopin och histologin hos den mänskliga perifera näthinnan av Foos och kollegor 11,12,13 och de omfattande AMD-klinopitopatologiska korrelationerna av Sarks et ^al.14,15. Från och med 2009 antogs ex vivo multimodal imaging (MMI) förankrad på spektraldomän OCT. Denna övergång inspirerades av liknande ansträngningar från andra 16,17 och särskilt av insikten att så mycket av den ultrastruktur som beskrivs av Sarks var tillgänglig i tre dimensioner, över tiden, i kliniken ^18,19. Målet var att förvärva ögon med bifogade makulor inom en rimlig tidsram för väldrivna studier av fenotyper på cellulär nivå i näthinnan, RPE och choroid. Avsikten var att gå bortom “per öga” -statistik till “per lesionstyp”, en standard som påverkas av “sårbara plack” -koncepten från hjärt-kärlsjukdom^20,21.

Protokollet i denna rapport återspeglar erfarenheter med nästan 400 par donatorögon anslutna i flera strömmar. Under 2011-2014 skapades Project MACULA-webbplatsen för AMD-histopatologi, som innehåller skikttjocklekar och anteckningar från 142 arkiverade exemplar. Dessa ögon bevarades från 1996-2012 i ett glutaraldehyd-paraformaldehydfixeringsmedel för högupplöst epoxihartshistologi och elektronmikroskopi. Alla fundi hade fotograferats i färg när de mottogs och reimagedes av OCT strax före histologi. En ögonhållare som ursprungligen utformades för optiska nervstudier²² användes för att rymma en 8 mm diameter fulltjocklek vävnadstans centrerad på fovea. OCT B-skanningar genom fovealcentret och en plats 2 mm överlägsen, motsvarande histologi på samma nivåer, laddades upp på webbplatsen, plus ett färgfundusfotografi. Valet av OCT-planen dikterades av AMD-patologins framträdande under fovea²³ och framträdandet av SDD i stavrika områden överlägsna fovea^24,25.

Från och med 2013 var ögon avbildade med OCT-förankrad MMI under livet tillgängliga för direkta kliniskopatologiska korrelationer. De flesta (7 av 10 donatorer) involverade patienter vid en retina-remisspraxis (författare: K.B.F.), som erbjöd ett avancerat direktivregister för patienter som var intresserade av att donera sina ögon efter döden för forskningsändamål. Ögonen återfanns och bevarades av den lokala ögonbanken, överfördes till laboratoriet och förbereddes på samma sätt som Project MACULA-ögonen. Pre-mortem kliniska OCT-volymer lästes sömlöst i laboratoriet, vilket anpassade de patologiska egenskaperna som ses under livet med de funktioner som ses under mikroskopet²⁶.

Från och med 2014 började prospektiv ögoninsamling genom screening för AMD i donatorögon utan klinisk historia men bevarad under en definierad tidsgräns (6 timmar). För detta ändamål modifierades ögonhållaren för att rymma en hel jordklot. Detta minskade risken för lossning runt de skurna kanterna på den tidigare använda 8 mm stansen. Ögonen bevarades i 4% buffrad paraformaldehyd för immunhistokemi och överfördes till 1% nästa dag för långtidsförvaring. Under 2016-2017 (före pandemin) återhämtades 184 ögon från 90 givare. Statistiken och bilderna i denna rapport genereras från denna serie. Under pandemitiden (2020 lockdowns och efterdyningar) fortsatte prospektiva samlingar för transkriptomik och IMS-samarbeten i minskad takt, i huvudsak med 2014-metoderna.

Andra metoder för bedömning av donatorögon finns tillgängliga. Minnesota Grading System (MGS)^27,28 är baserat på AREDS kliniska system för färgfundusfotografering ²⁹. Begränsningarna av denna metod innefattar kombinationen av atrofisk och neovaskulär AMD i ett stadium av “sen AMD”. Vidare innebär MGS avlägsnande av den neurosensoriska näthinnan före fotodokumentationen av RPE-koroid. Detta steg avlägsnar SDD i varierande grad^30,31 och tar bort den yttre näthinnans rumsliga korrespondens och dess stödsystem. Således kan ansträngningar att koppla metabolisk efterfrågan och signalering från näthinnan till patologi i RPE-choroid hindras. Utah-systemet implementerade MMI med ex vivo-färgfotografering och OCT för att kategorisera ögon avsedda för dissektion i regioner för RNA- och proteinextraktioner³². Även om det är att föredra framför extraktioner av hela ögonmusslor, representerar området med 3 mm diameter med högsta risk för AMD-progression^33,34 endast 25% av en 6 mm diameter fovea-centrerad stans. Således är tekniker som kan lokalisera fynd med hänvisning till fovea, såsom seriesnittning för immunhistokemi, fördelaktiga.

Protocol

Den institutionella granskningsnämnden vid University of Alabama i Birmingham godkände laboratoriestudierna, som följde god laboratoriesed och biosäkerhetsnivå 2/2+. Alla amerikanska ögonbanker följer 2006 Uniform Anatomical Gifts Act och US Food and Drug Administration. De flesta amerikanska ögonbanker, inklusive Advancing Sight Network, överensstämmer med de medicinska standarderna från Eye Bank Association of America. Materialförteckningen listar förnödenheter…

Representative Results

Tabell 1 visar att under 2016-2017 återfanns 184 ögon från 94 vita icke-diabetiska donatorer >80 år. Den genomsnittliga tiden för död till konservering var 3,9 timmar (intervall: 2,0-6,4 timmar). Av de 184 granskade ögonen hade 75 (40,2%) viss AMD. Följande kategorier identifierades: Unremarkable (39,7%), tvivelaktig (11,4%), tidig intermediär AMD (22,8%), atrofisk (7,6%), neovaskulär (9,8%), annan (8,7%) och okänd / inte registrerad / inte graderbar (<1%). Figur 2</strong…

Discussion

Med hjälp av en populationsbaserad screeningmetod under en 16-månadersperiod före COVID-eran var det möjligt att skaffa 75 donatorögon med AMD. Alla återfanns med en kort DtoP och iscensattes med OCT-förankrad MMI. Ålderskriteriet (>80 år) ligger utanför det typiska åldersintervallet för vävnadsåtervinning avsedd för transplanterbara hornhinnor. Trots den höga åldern resulterade våra kriterier i ögon i alla stadier av AMD. Många RPE-fenotyper är gemensamma för alla AMD-stadier, och vissa är exklusi…

Materials

Beakers, 250 mL	Fisher	# 02-540K
Bottles, 1 L, Pyrex	Fisher	# 10-462-719	storage for preservative
Bunsen burner or heat source	Eisco	# 17-12-818	To melt wax
Camera, digital	Nikon D7200	D7200
Computer and storage	Apple	iMac Pro; 14 TB external hard drive	Image storage
Container, insulated	Fisher	# 02-591-45	For wet ice
Containers, 2 per donor, 40 mL	Fisher	Sameco Bio-Tite  40 mL # 13-711-86	For preservative
Crucible, quartz 30 mL	Fisher	# 08-072D	Hold globe for photography
Cylinder, graduate, 250 mL	Fisher	# 08-549G
Disinfectant cleaning supplies			https://www.cardinalhealth.com/en/product-solutions/medical/infection-control/antiseptics.html
Eye holder with lens and mounting bracket	contact J. Messinger	jeffreymessinger@uabmc.edu	custom modification of Heidelberg Engineering original design
Face Protection Masks	Fisher	# 19-910-667
Forceps, Harmon Fix	Roboz	# RS-8247
Forceps, Micro Adson	Roboz	# RS-5232
Forceps, Tissue	Roboz	# RS-5172
Glass petri dish, Kimax	Fisher	# 23064
Gloves Diamond Grip	Fisher	# MF-300
Gowns GenPro	Fisher	# 19-166-116
Image editing software	Adobe	Photoshop 2021, Creative Suite
KimWipes	Fisher	# 06-666
Lamps, 3 goosenecks	Schott Imaging	# A20800
Microscope, stereo	Nikon	SMZ 1000	for dissection
Microscope, stereo	Olympus	SZX9	color fundus photography
Paraformaldehyde, 20%	EMS	# 15713-S	for preservative; dilute for storage
pH meter	Fisher	# 01-913-806
Phosphate buffer, Sorenson’s, 0.2 M pH 7.2	EMS	# 11600-10
Ring flash	B & H Photo Video	Sigma EM-140 DG
Ruby bead, 1 mm diameter	Meller Optics	# MRB10MD
Safety Glasses 3M	Fisher	# 19-070-940
Scanning laser ophthalmoscope	Heidelberg Engineering	HRA2
Scissors, curved spring	Roboz	# RS-5681
Sharps container	Fisher	# 1482763
Shutter cord, remote	Nikon	MC-DC2
Spectral Domain OCT device	Heidelberg Engineering	Spectralis HRA&OCT	https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf
Stainless steel ball bearing, 25.4 mm diameter	McMaster-Carr	# 9529K31
Tissue marking dye, black	Cancer Diagnostics Inc	# 0727-1
Tissue slicer blades	Thomas Scientific	# 6767C18
Trephine, 18-mm diameter	Stratis Healthcare	# 6718L
TV monitor (HDMI) and cord for digital camera	B&H Photo Video	BH # COHD18G6PROB	for live viewing and remote camera display features
Wax, pink dental	EMS	# 72670
Wooden applicators	Puritan	# 807-12