अच्छी तरह से संरक्षित अल्ट्रास्ट्रक्चर के साथ प्रोटीन स्थानीयकरण विश्लेषण के लिए कोशिकाओं में ईएम-दृश्यमान सोने के नैनोकणों का प्रत्यक्ष संश्लेषण
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल एक नए ऑटोन्यूक्लियेशन दमन तंत्र-आधारित सोने के नैनोपार्टिकल संश्लेषण तकनीक का उपयोग करके कोशिकाओं में मेटलोथियोनिन-टैग किए गए प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक क्लोनेबल इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी लेबलिंग तकनीक का वर्णन करता है।
Abstract
अल्ट्रास्ट्रक्चरल रिज़ॉल्यूशन के साथ कोशिकाओं में प्रोटीन अणुओं के सटीक स्थानीयकरण का विश्लेषण करना सभी जीवित जीवों में विभिन्न शारीरिक या रोग प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। इसलिए, क्लोनेबल टैग का विकास जिसे इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी जांच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, बहुत मूल्य का है, जैसे फ्लोरोसेंट प्रोटीन ने ऑप्टिकल इमेजिंग के क्षेत्र में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है। ऑटोन्यूक्लियेशन दमन तंत्र (एएनएसएम) को हाल ही में उजागर किया गया था, जो सिस्टीन-समृद्ध टैग, जैसे मेटलोथियोनिन (एमटी) और एंटीफ्ऱीज़ प्रोटीन (एएफपी) पर सोने के नैनोकणों (एयूएनपी) के विशिष्ट संश्लेषण की अनुमति देता है।
एएनएसएम के आधार पर, एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी लेबलिंग तकनीक विकसित की गई थी, जो एक अभूतपूर्व लेबलिंग दक्षता के साथ प्रोकैरियोटिक और यूकेरियोटिक कोशिकाओं में टैग किए गए प्रोटीन का विशिष्ट पता लगाने में सक्षम बनाती है। यह अध्ययन अच्छी तरह से संरक्षित अल्ट्रास्ट्रक्चर के साथ स्तनधारी कोशिकाओं में एमटीएन (एल्डिहाइड-प्रतिक्रियाशील अवशेषों की कमी वाला एक इंजीनियर एमटी संस्करण) संलयन प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल दिखाता है। इस प्रोटोकॉल में, उच्च दबाव ठंड और फ्रीज-प्रतिस्थापन निर्धारण गैर-एल्डिहाइड फिक्सेटिव (जैसे टैनिक एसिड, यूरिनिल एसीटेट) का उपयोग करके किया गया था ताकि निकट-देशी अल्ट्रास्ट्रक्चर को संरक्षित किया जा सके और एल्डिहाइड क्रॉसलिंकिंग के कारण टैग गतिविधि को नुकसान से बचाया जा सके।
एएनएसएम-आधारित एयूएनपी संश्लेषण से पहले एक सरल एक-चरण पुनर्जलीकरण का उपयोग किया गया था। परिणामों से पता चला कि टैग किए गए प्रोटीन ने एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) के झिल्ली और लुमेन सहित विभिन्न ऑर्गेनेल को लक्षित किया, और माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिसेस का उच्च दक्षता और विशिष्टता के साथ पता लगाया गया। यह शोध जीवविज्ञानियों को सेलुलर अल्ट्रास्ट्रक्चरल संदर्भों में एकल-अणु स्तर पर जैविक प्रश्नों की एक विशाल श्रृंखला को संबोधित करने के लिए एक मजबूत प्रोटोकॉल प्रदान करता है।
Introduction
पोस्टजीनोमिक युग में, प्रकाश माइक्रोस्कोपी के लिए एकल-अणु रिपोर्टर के रूप में हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) के विकास ने आधुनिक जीवन विज्ञान अनुसंधान 1,2 के क्षेत्र में क्रांति ला दी है। दशकों से, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) नैनोस्केल रिज़ॉल्यूशन3 के साथ सेलुलर अल्ट्रास्ट्रक्चर को सहज रूप से देखने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण रहा है; हालांकि, प्रोटीन अणुओं की सटीक पहचान और स्थानीयकरण चुनौतीपूर्ण बना हुआ है।
सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली ईएम लेबलिंग तकनीक इम्यूनोइलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (आईईएम) लेबलिंग तकनीक है, जो एंटीजन-एंटीबॉडी प्रतिक्रिया पर आधारित है। हालांकि, हालांकि आईईएम लेबलिंग के क्षेत्र में कई तकनीकों को विकसित किया गया है, जिसमें पूर्व-एम्बेडिंग आईईएम और पोस्ट-एम्बेडिंग आईईएम (राल अनुभागों या हाइड्रेटेड क्रायोसेक्शन पर) शामिल हैं, फिर भी यह कम लेबलिंग दक्षता (<10%) 4,5 से ग्रस्त है, जो नमूना तैयारी और एंटीबॉडी गुणवत्ता से संबंधित है। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड टैग विकसित करने में बड़ी अनुप्रयोग क्षमता है।
हाल के वर्षों में दो मुख्य प्रकार के ईएम टैग का पूरी तरह से पता लगाया गया है। एक प्रकार डीएबी स्टेनिंग विधि है, जो ईएम विज़ुअलाइज़ेशन 6,7,8,9,10,11,12 के लिए ओस्मियोफिलिक पॉलिमर में 3,3‘-डायमिनोबेंज़िडीन (डीएबी) को ऑक्सीकरण करने के लिए एपेक्स 2 जैसे टैग का उपयोग करता है। यह उपकोशिकीय क्षेत्रों में उच्च-बहुतायत प्रोटीन के लेबलिंग को सक्षम बनाता है लेकिन एकल-अणु गिनती के लिए उपयुक्त नहीं है। अन्य प्रकार धातु-बाध्यकारी प्रोटीन का उपयोग करता है, जैसे फेरिटिन 13 और मेटलोथियोनिन (एमटी) 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, ईएम विज़ुअलाइज़ेशन के लिए सीटू। केवल उत्तरार्द्ध में एकल-अणु विज़ुअलाइज़ेशन और गिनती के लिए वास्तविक क्षमता है। फेरिटिन का आणविक आकार एक आशाजनक टैग के रूप में उपयोग किए जाने के लिए बहुत बड़ा (~ 450 केडी) है, जबकि एमटी के छोटे आकार (~ 5 केडी) और इसके 20 सिस्टीन के माध्यम से विभिन्न आयनों को बांधने की इसकी क्षमता ने बहुत ध्यान आकर्षित किया है। कई प्रयोगशालाओं ने एयू + के साथ सीधे इंजेक्ट करके शुद्ध एमटी-फ्यूजन प्रोटीन या एमटी-व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को लेबल करने की कोशिश की है। इन प्रयासों ने शुरू में साबित कर दिया है कि एमटी टैग उच्च-कंट्रास्ट सिग्नल बनाने के लिए सोने के आयनों को बांध सकते हैं, लेकिन किसी ने भी वास्तव में कोशिकाओं में व्यक्तिगत प्रोटीन की प्रभावी पहचान हासिल नहीं की है, और वे व्यापक रूप से लागू नहीं हैं 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23।
एएनएसएम-आधारित एयूएनपी संश्लेषण तकनीक, जिसमें ईएम विज़ुअलाइज़ेशन के लिए इलेक्ट्रॉन-घने लेबल के रूप में सिस्टीन-समृद्ध टैग (जैसे, एमटी, एमटी वेरिएंट एमटीएन और एमटी, एएफपी) पर सीधे 2-6 एनएम-आकार के एयूएनपी को संश्लेषित करना शामिल है, कोशिकाओं में प्रोटीन लेबलिंग और एकल अणु का पता लगाने के लिए पहला विश्वसनीय और लागू दृष्टिकोण है।. यह पृथक टैग संलयन प्रोटीन पर एयूएनपी के विशिष्ट संश्लेषण की अनुमति देता है और गैर-निर्धारित या रासायनिक रूप से निश्चित प्रोकैरियोटिक (ई कोलाई) और यूकेरियोटिक (एस पोम्बे) कोशिकाओं में एक अभूतपूर्व लेबलिंग दक्षता हासिल की है। हालांकि, स्तनधारी कोशिकाओं या यहां तक कि ऊतकों जैसे अधिक उन्नत प्रणालियों में एक ही प्रोटोकॉल को लागू करने में अतिरिक्त चुनौतियां शामिल हैं, जैसे कि अधिक जटिल इंट्रासेल्युलर रेडॉक्स होमियोस्टैसिस और अधिक नाजुक सेलुलर संरचना।
यह अध्ययन एक क्लोनेबल ईएम लेबलिंग तकनीक प्रस्तुत करता है, जो एचपीएफ / एफएसएफ-पुनर्जलीकरण-एचपीएफ / एफएसएफ नमूना तैयारी विधि के साथ आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सिस्टीन-समृद्ध टैग (एमटी) को लेबल करने के लिए नई एएनएसएम-आधारित एयूएनपी संश्लेषण तकनीक को जोड़ती है, ईआर झिल्ली, ईआर लुमेन और हेला कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स में टैग किए गए प्रोटीन की स्पष्ट एकल-अणु पहचान को सक्षम बनाती है। वर्तमान विधि उच्च लेबलिंग दक्षता, एक उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात, एकल-अणु लेबलिंग और मजबूत सार्वभौमिकता की विशेषताओं को जोड़ती है, और इस विधि में जीवन विज्ञान अनुसंधान में व्यापक अनुप्रयोग संभावनाएं हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
अध्ययन यहां अल्ट्रास्ट्रक्चरल रिज़ॉल्यूशन के साथ सेलुलर वातावरण के भीतर प्रोटीन अणुओं के एकल-अणु विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एक मजबूत क्लोनेबल ईएम लेबलिंग तकनीक प्रस्तुत करता है। आनुवंशिक रूप से एन्कोड?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यहां वर्णित प्रोटोकॉल जियांग एट अल (2020) द्वारा प्रकाशित लेख से लिया गया था। इस काम को MOST (973 कार्यक्रम संख्या 2011CB812502 और 2014CB849902) से अनुदान और बीजिंग नगरपालिका सरकार से वित्त पोषण सहायता द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrier | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| 0.2 M HEPES buffer | Dissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5 | ||
| 1.5 mL MaxyClear snaplock microtube | Axygen Scientific | MCT150C | |
| 2 mL polypropylene screw cap microtubes | Biologix | 81-0204 | |
| 200 mesh hexagonal copper grid | Tedpella inc | G200HEX | |
| 2-mercaptoethanol | Amresco | 0482-250ML | |
| 35 mm cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430928 | |
| Acetone | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 31025 | |
| Automated freeze substitution machine | Leica | AFS2 | |
| Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPF | Beijing Wulundes Biotech Ltd. | ||
| D-penicillamine | TCI | P0147 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium | GBICO | C11965500BT | |
| Fetal bovine serum | GBICO | 10099-141C | |
| Flat bottom embedding capsule | Tedpella inc | ||
| Foam cryobox | |||
| Formvar 15/95 resin | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| HAuCl4 | Sigma | 4022-1G | |
| HEPES | sigma | H3375-500G | |
| HPF machine | Wohlwend | HPF compact01 | |
| Methonal | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 12397 | |
| NaBH4 | Sigma | 480886-25G | |
| OsO4 | Electron Microscopy Sciences | 19110 | |
| PBS-A buffer | Dissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4 | ||
| Qualitative filter paper (medium speed) | Beyotime Biotechnology | FFT08 | |
| Sapphire discs | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| Solvent resistant pen | Electron Microscopy Sciences | 62053-B | |
| SPI-Pon 812 resin | SPI Inc | 02659-AB | |
| Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 spirit | |
| Trypsin-EDTA | GBICO | C25200-056 | |
| Tweezers | Dumont | ||
| Ultramictotome | Leica | FC7 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
Referências
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120, 4247-4260 (2007).
- Masters, B. R. History of the electron microscope in cell biology. Encylopedia of Life Sciences. , (2009).
- Griffiths, G., Hoppeler, H. Quantitation in immunocytochemistry: Correlation of immunogold labeling to absolute number of membrane antigens. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 34 (11), 1389-1398 (1986).
- Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. Journal of Cell Biology. 57 (2), 551-565 (1973).
- Connolly, C. N., Futter, C. E., Gibson, A., Hopkins, C. R., Cutler, D. F. Transport into and out of the Golgi complex studied by transfecting cells with cDNAs encoding horseradish peroxidase. Journal of Cell Biology. 127 (3), 641-652 (1994).
- Grabenbauer, M., et al. Correlative microscopy and electron tomography of GFP through photooxidation. Nature Methods. 2 (11), 857-862 (2005).
- Gaietta, G., et al. Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science. 296 (5567), 503-507 (2002).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biology. 9 (4), e1001041 (2011).
- Martell, J. D., et al. Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy. Nature Biotechnology. 30 (11), 1143-1148 (2012).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
- Mavlyutov, T. A., et al. APEX2-enhanced electron microscopy distinguishes sigma-1 receptor localization in the nucleoplasmic reticulum. Oncotarget. 8 (31), 51317-51330 (2017).
- Wang, Q., Mercogliano, C. P., Lowe, J. A ferritin-based label for cellular electron cryotomography. Structure. 19 (2), 147-154 (2011).
- Sano, T., Glazer, A. N., Cantor, C. R. A streptavidin-metallothionein chimera that allows specific labeling of biological materials with many different heavy metal ions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (5), 1534-1538 (1992).
- Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Gold nanocluster formation using metallothionein: Mass spectrometry and electron microscopy. Journal of Molecular Biology. 355 (2), 211-223 (2006).
- Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Concatenated metallothionein as a clonable gold label for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 160 (1), 70-82 (2007).
- Morphew, M. K., et al. Metallothionein as a clonable tag for protein localization by electron microscopy of cells. Journal of Microscopy. 260 (1), 20-29 (2015).
- Nishino, Y., Yasunaga, T., Miyazawa, A. A genetically encoded metallothionein tag enabling efficient protein detection by electron microscopy. Journal of Electron Microscopy. 56 (3), 93-101 (2007).
- Bouchet-Marquis, C., Pagratis, M., Kirmse, R., Hoenger, A. Metallothionein as a clonable high-density marker for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 177 (1), 119-127 (2012).
- Fukunaga, Y., et al. Electron microscopic analysis of a fusion protein of postsynaptic density-95 and metallothionein in cultured hippocampal neurons. Journal of Electron Microscopy. 56 (4), 119-129 (2007).
- Diestra, E., Fontana, J., Guichard, P., Marco, S., Risco, C. Visualization of proteins in intact cells with a clonable tag for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 165 (3), 157-168 (2009).
- Risco, C., et al. sensitive, high-resolution detection of protein molecules in eukaryotic cells using metal-tagging transmission electron microscopy. Structure. 20 (5), 759-766 (2012).
- Ding, S. -. W., et al. Noncanonical role for the host Vps4 AAA+ ATPase ESCRT protein in the formation of tomato bushy stunt virus replicase. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004087 (2014).
- Jiang, Z., et al. Direct synthesis of gold nanoparticles on cysteine-rich tags in yeast cells. Protocol Exchange. , (2020).
- Jiang, Z., et al. Direct synthesis of gold nanoparticles on cysteine-rich tags in mammalian cells. Protocol Exchange. , (2020).
- Jiang, Z., et al. Genetically encoded tags for direct synthesis of EM-visible gold nanoparticles in cells. Nature Methods. 17 (9), 937-946 (2020).
- Brust, M., Walker, M., Bethell, D., Schiffrin, D. J., Whyman, R. Synthesis of thiol-derivatised gold nanoparticles in a two-phase liquid-liquid system. Journal of the Chemical Society, Chemical Communications. 7, 801-802 (1994).
