Vi presenterer en to-trinns protokoll for høykvalitets mitokondrieisolering som er kompatibel med proteinoppdagelse og kvantifisering på proteomskala. Vår protokoll krever ikke genteknologi og er dermed egnet for å studere mitokondrier fra primære celler og vev.
De fleste fysiologiske prosesser og sykdomsprosesser, fra sentral metabolisme til immunrespons mot nevrodegenerasjon, involverer mitokondrier. Mitokondriell proteom består av mer enn 1000 proteiner, og overflod av hver kan variere dynamisk som respons på ytre stimuli eller under sykdomsprogresjon. Her beskriver vi en protokoll for isolering av mitokondrier av høy kvalitet fra primære celler og vev. To-trinns prosedyren omfatter (1) mekanisk homogenisering og differensialsentrifugering for å isolere rå mitokondrier, og (2) tagfri immunfangst av mitokondrier for å isolere rene organeller og eliminere forurensninger. Mitokondrielle proteiner fra hvert rensetrinn analyseres ved kvantitativ massespektrometri, og anrikningsutbytter beregnes, slik at oppdagelsen av nye mitokondrielle proteiner ved subtraktiv proteomikk kan oppdages. Vår protokoll gir en sensitiv og omfattende tilnærming til å studere mitokondrielt innhold i cellelinjer, primære celler og vev.
Mitokondrier er komplekse og dynamiske organeller som er i stand til å fornemme og tilpasse seg cellens metabolske behov. Mitokondrier er sentrale for kompleksiteten i cellulær metabolisme og fungerer som metabolske knutepunkter der karbohydrat-, protein-, lipid-, nukleinsyre- og kofaktormetabolismereaksjoner konvergerer1. De tjener også som signalorganeller for veier av den medfødte immunresponsen og som respons på endringer i ioner og reaktive oksygenarter 2,3. Hittil har rundt 1,100 proteiner blitt kartlagt til mitokondrier 4,5,6, men vi kan anta at mange flere gjenstår å bli oppdaget, spesielt de som bare uttrykkes i visse celletyper eller forbigående under spesifikke miljøforhold. Utvikling av nye tilnærminger for å kvantifisere endringer i mitokondriell sammensetning i metabolske tilstander av interesse vil øke vår kunnskap om disse organellene og fremheve nye terapeutiske veier for lidelsene preget av mitokondriell dysfunksjon7.
For tiden er forskjellige mitokondrieisolasjonsprotokoller tilgjengelige, med forskjellige utbytter og renhetsnivåer8. Sentrifugeringsbaserte tilnærminger er de mest populære på grunn av deres enkelhet og lave kostnader. Selv om differensiell sentrifugering er egnet for de fleste applikasjoner, har den ulempen at den oppnår lavere mitokondriell renhet og krever store mengder utgangsmateriale når mer komplekse tetthetsgradientbaserte applikasjoner brukes. De siste årene har nye metoder for mitokondrieisolering dukket opp, som tag-basert immunfangst (“MITO-IP”)9 og fluorescensaktivert organellsortering10. Selv om begge prosedyrene kan generere prøver med høy renhet, krever førstnevnte genteknologi for å merke mitokondrier for affinitetsrensing, noe som gjør protokollene uforenlige med primærmateriale fra umodifiserte organismer eller menneskelige givere. Samtidig er sistnevnte avhengig av tilgang til flowcytometri og sorteringsinstrumenter. Å kombinere forskjellige isolasjonsmetoder gir løftet om å generere mer robuste protokoller og økt renhet.
Her presenterer vi en ny protokoll for mitokondrieisolering basert på kombinasjonen av to eksisterende metoder: (1) differensiell sentrifugering for å isolere en rå mitokondriefraksjon, og (2) tagfri immunopptak av mitokondrier med superparamagnetiske perler kovalent bundet til antistoffer mot translokase av ytre mitokondriemembran 22 (Tomm22)11, et allestedsnærværende mitokondrielt ytre membranprotein (figur 1). Prosedyren vi beskriver er kompatibel med kvantitativ proteinmassespektrometri, og fordi den er tagfri og ikke krever genetisk manipulasjon, kan den brukes på et bredt spekter av forskningsmodeller, fra cellelinjer til kroppsvæsker til hele dyrevev. Videre muliggjør bruken av to trinn i protokollen bruk av subtraktiv proteomikk 6,12 for oppdagelsen av nye mitokondrielle proteiner og studiet av deres uttrykk.
Vi har kombinert differensialsentrifugering og immunfangst for å oppnå en forbedret renhet for mitokondrieisolering. Vår prosedyre gir tilgang til primærmateriale for identifisering og karakterisering av nye mitokondrielle proteiner. Protokollen er enkel og robust, og kan brukes på cellelinjer, primære celler og vev uten behov for genetisk modifisering. Vi har validert protokollen vår ved immunblotting og proteomikkanalyser på prøver tatt på forskjellige stadier gjennom renseprosedyren.
Sammenlignet med enkeltisolasjonsmetoder genererer kombinasjonen av anrikningstrinn av forskjellig art – her sentrifugering og immunmerking – en mer robust protokoll for å isolere mitokondrier. Dette skyldes at mens mitokondrielle proteiner vil bli beriket i begge rensingene, er det lite sannsynlig at forurensninger også vil bli anriket etter begge anrikningstrinnene. Selv om høy mitokondriell renhet også kan oppnås ved ultrasentrifugering av tetthetsgradient, krever denne tilnærmingen en stor mengde utgangsmateriale og tilgang til en ultrasentrifuge. Til slutt, i motsetning til nyere metoder basert på tag-basert mitokondriell isolasjon20, krever vår tilnærming ikke genetisk modifisering av prøven, noe som gjør den egnet for primærmateriale fra hvilken som helst kilde.
Noen tekniske og biologiske hensyn må tas i betraktning i det eksperimentelle designet når vi bruker protokollen vår. (1) Mengden utgangsmateriale er kritisk for å oppnå tilstrekkelig materiale. Uunngåelig vil et lite antall mitokondrier gå tapt under homogenisering (trinn 3.10), da ikke alle celler lyseres, eller under de tre kolonnevaskene (trinn 4.6). Mens protokollen vår fokuserer på renhet over utbytte, har effektiviteten av mitokondrieisolering, og dermed utbyttet, ikke blitt målt eller optimalisert. Bruk av flere Tomm22-perler og flere kolonner forventes å øke utbyttet av mitokondrieutvinning. Samtidig kan en grundig optimalisering av homogeniseringstrinnet også føre til forbedret mitokondrielt utbytte. Denne protokollen og de første cellenumrene vi rapporterer her for RAW264.7-celler og BMDM-er, er tilstrekkelige for proteomikk og kan justeres for andre applikasjoner. Når det gjelder primære BMDM-er, fant vi at en enkelt mus var tilstrekkelig for en replikasjon. Når det er nødvendig, kan prosedyren skaleres opp for å isolere BMDM fra flere dyr, som deretter kan samles for å oppnå tilstrekkelig materiale. Cellenummeret kan optimaliseres avhengig av celletype, størrelse og mitokondrieinnhold. (2) Tomm22 uttrykkes på mitokondrier fra alle celletyper og vev21, men uttrykksnivået kan variere. Når du designer et eksperiment for å sammenligne forskjellige forhold, er det derfor viktig å sikre at uttrykksnivåene til Tomm22 er sammenlignbare. Videre, på grunn av det allestedsnærværende uttrykket av Tomm22, er det ikke mulig å studere celletypespesifikke mitokondrielle proteiner i komplekse vev. (3) Tiden som er nødvendig for å generere rene mitokondrier (ca. 2,5 timer) er uforenlig med en studie av forbigående hendelser, for eksempel endringer i metabolske profiler. I dette tilfellet anbefaler vi direkte tag-basert immunfangst9, som også gjør det mulig å studere celletypespesifikke mitokondrier in vivo20. (4) Selv om studier på isolerte mitokondrier oppnådd ved bruk av Tomm22-antistoffmerkede perler alene har vist aktivitet i funksjonelle analyser11, gjenstår det å avgjøre om mitokondrier generert med protokollen vår er kompatible med nedstrøms aktivitetsbaserte analyser. MitoTracker eller tetrametylrhodamin metylester perklorat (TMRM) farging, eller respirometrimålinger, er potensielle tilnærminger for å kvantifisere funksjonaliteten til isolerte mitokondrier22. (5) Etter å ha eluert den “mito-rene” prøven fra kolonnen, vil noen Tomm22-perler være til stede i den rene mitokondriefraksjonen (Figur 2B). Selv om vi ikke har observert noen interferens med trypsinfordøyelse og proteinmassespektrometri, bør tilstedeværelsen av disse kulene og immunglobulinene tas i betraktning i andre nedstrøms applikasjoner. Tomm22-antistoffet er et monoklonalt antistoff produsert hos mus23, og derfor er det viktig å huske på at når du bruker sekundære antistoffer mot mus i immunoblotting, vil det generere uspesifikke bånd ved størrelsen på immunoglobulinkjedene. (6) Fullstendig homogenisering av cellesuspensjonen er nøkkelen til vellykket isolering av mitokondrier. Her bruker vi en sprøyte med 25 G kanyle til å lyse både RAW264.7-celler og BMDM-er. Imidlertid, avhengig av celletype og dens størrelse, kan andre mekaniske homogeniseringsmetoder, for eksempel bruk av en Dounce-homogenisator, eller mer kontrollerte tilnærminger som cellehomogeniseringsanordninger, være mer egnet. Ikke-mekaniske homogeniseringsmetoder, som mild lydbehandling, kan også vurderes. Vevshomogeniseringstilnærminger er videre diskutert i andre studier24,25. (7) Selv om validering ved immunoblotting er den enkleste og billigere metoden, kan resultatene ikke alltid korrelere med endringer på hele organellnivået. Derfor anbefaler vi å bruke proteomikk for å fullt ut validere anrikning eller uttømming av henholdsvis mitokondrier og andre organeller.
To-trinns mitokondrierensingsprotokollen beskrevet her har gitt oss mulighet til å generere sekvensielle prøver med økende mitokondriell renhet, og dette har gjort det mulig for oss å oppdage nye mitokondrielle proteinkandidater gjennom subtraktiv proteomikk12. For vår analyse bruker vi strenge terskler for å selektere for signifikant anrikede mitokondrieproteiner, og selv om dette kanskje ikke identifiserer noen kjente mitokondrielle proteiner (figur 3A), reduseres den falske positive raten for ny mitokondriell proteinoppdagelse. Likevel er det viktig å understreke at eventuelle kandidatproteiner avslørt av protokollen vår må valideres gjennom ortogonale tilnærminger. Vi anbefaler karboksyterminal GFP-merking eller bruk av antistoffer mot det endogene proteinet for å validere assosiasjon til mitokondrier enten mikroskopisk eller ved proteasebeskyttelsestester.
Den direkte anvendelsen av vår metode i tilfelle av umodifiserte celler og vev gir et kraftig verktøy for å undersøke hvordan mitokondrier endres og tilpasser seg deres miljø i sunne og sykdomsforhold. Anvendelse av vår protokoll til cellelinjer, dyresykdomsmodeller, humane væsker og til og med biopsier fra kirurgi kan vise seg å være spesielt nyttig for å forbedre vår forståelse av mitokondrier og deres tilknyttede lidelser.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Manfredo Quadroni, Protein Analysis Facility, og Electron Microscopy Facility ved Universitetet i Lausanne for deres hjelp. Vi takker også H.G. Sprenger, K. Maundrell og medlemmer av Jourdain-laboratoriet for råd og tilbakemelding på manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av stiftelsen Pierre-Mercier pour la Science, og Swiss National Science Foundation (prosjektstipend 310030_200796).
1 mL syringe | BD Plastipal | 309628 | |
25 G Needle | BD Microlance | 300400 | |
40 µm cell strainer | Corning | 352340 | |
Anti-TOM22 Microbeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-127-693 | |
Cell scraper | FisherScientific | 11577692 | |
DMEM, high glucose, GlutaMAX | ThermoFisher | 31966 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | FisherScientific | BP-120-1 | |
Fetal bovine serum | Gibco | 10270 | |
HEPES | BioConcept | 5-31F00-H | |
LS columns and plungers | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
Macrophage colony-stimulating factor | Immunotools | 12343115 | |
Mannitol | Sigma | M4125 | |
Sodium chloride | Sigma | 71380 | |
Sucrose | Sigma | S1888 | |
Penicillin/Streptomycin | BioConcept | 4-01F00-H | |
Petri dishes | Corning | BH93B-102 | |
Phosphate-buffered saline 10X | Eurobio Scientific | CS3PBS01-01 | |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
Vi-CELL BLU Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter | C19196 |