सिंगल-न्यूक्लियस सीक्वेंसिंग या इम्यूनोस्टेनिंग के लिए वयस्क माउस स्ट्रिया संवहनी का विच्छेदन
Summary
स्ट्रिया संवहनी एंडोकोक्लियर क्षमता की पीढ़ी के लिए महत्वपूर्ण है। यहां, हम एकल-नाभिक अनुक्रमण या इम्यूनोस्टेनिंग के लिए वयस्क माउस स्ट्रिया संवहनी के विच्छेदन को प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
एंडोकोक्लियर क्षमता, जो स्ट्रिया संवहनी द्वारा उत्पन्न होती है, उचित बाल कोशिका मेकेनोट्रांसडक्शन और अंततः सुनवाई के लिए अनुकूल वातावरण बनाए रखने के लिए आवश्यक है। स्ट्रिया संवहनी के विकृति के परिणामस्वरूप सुनवाई में कमी हो सकती है। वयस्क स्ट्रिया संवहनी का विच्छेदन केंद्रित एकल-नाभिक कैप्चर और बाद में एकल-नाभिक अनुक्रमण और इम्यूनोस्टेनिंग की अनुमति देता है। इन तकनीकों का उपयोग एकल-कोशिका स्तर पर स्ट्रिया संवहनी पैथोफिज़ियोलॉजी का अध्ययन करने के लिए किया जाता है।
एकल-नाभिक अनुक्रमण का उपयोग स्ट्रिया संवहनी के ट्रांसक्रिप्शनल विश्लेषण की स्थापना में किया जा सकता है। इस बीच, इम्यूनोस्टेनिंग कोशिकाओं की विशिष्ट आबादी की पहचान करने में उपयोगी है। दोनों विधियों को एक शर्त के रूप में उचित स्ट्रिया संवहनी विच्छेदन की आवश्यकता होती है, जो तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण साबित हो सकती है।
Introduction
कोक्लेया में तीन द्रव भरे कक्ष होते हैं, स्काला वेस्टिबुली, स्काला मीडिया और स्काला टाइम्पानी। स्काला वेस्टिबुली और स्काला टाइम्पानी प्रत्येक में पेरिलिम्फ होता है, जिसमें सोडियम (138 एमएम) की उच्च सांद्रता और पोटेशियम की कम सांद्रता (6.8 एमएम) होती है। स्काला मीडिया में एंडोलिम्फ होता है, जिसमें पोटेशियम (154 एमएम) की उच्च सांद्रता और सोडियम (0.91 एमएम) 1,2,3 की कम सांद्रता होती है। आयन सांद्रता में इस अंतर को एंडोकोक्लियर पोटेंशियल (ईपी) के रूप में संदर्भित किया जा सकता है, और मुख्य रूप से कोक्लेया 4,5,6,7,8,9,10,11 की पार्श्व दीवार के साथ स्ट्रिया संवहनी (एसवी) में विभिन्न आयन चैनलों और गैप जंक्शनों के माध्यम से पोटेशियम आयनों की गति से उत्पन्न होता है।. एसवी एक विषमलैंगिक, अत्यधिक संवहनी ऊतक है जो कोक्लेया की पार्श्व दीवार के उपचारात्मक पहलू को रेखाबद्ध करता है और इसमें तीन मुख्य सेल प्रकार होते हैं: सीमांत, मध्यवर्ती और बेसल कोशिकाएं12 (चित्रा 1)।
सीमांत कोशिकाओं को एसवी की सबसे औसत दर्जे की सतह बनाने के लिए तंग जंक्शनों से जोड़ा जाता है। एपिकल झिल्ली स्काला मीडिया के एंडोलिम्फ का सामना करती है और विभिन्न चैनलों का उपयोग करके एंडोलिम्फ में पोटेशियम आयन परिवहन में योगदान देती है, जिसमें केसीएनई 1 / KCNQ1, SLC12A2, और Na+-K+-ATPase (NKA) 5,10,13,14 शामिल हैं। मध्यवर्ती कोशिकाएं वर्णक कोशिकाएं होती हैं जो सीमांत और बेसल कोशिकाओं के बीच रहती हैं और केसीएनजे 10 (किर 4.1)15,16 का उपयोग करके एसवी के माध्यम से पोटेशियम परिवहन की सुविधा प्रदान करती हैं। बेसल कोशिकाएं कोक्लेया की पार्श्व दीवार के करीब निकटता में होती हैं और पेरिलिम्फ12 से पोटेशियम रीसाइक्लिंग को बढ़ावा देने के लिए सर्पिल लिगामेंट के फाइब्रोसाइट्स के साथ निकटता से जुड़ी होती हैं। एसवी की पैथोलॉजी को कई ओटोलॉजिक विकारों17,18 में फंसाया गया है। प्रमुख एसवी सेल प्रकारों में व्यक्त जीन में उत्परिवर्तन, जैसे कि Kcnq1, Kcne1, Kcnj10, और Cldn11, बहरापन और SV शिथिलता का कारण बन सकता है, जिसमें EP 19,20,21,22,23 का नुकसान भी शामिल है। तीन प्रमुख सेल प्रकारों के अलावा, एसवी में अन्य कम अध्ययन किए गए सेल प्रकार हैं, जैसे स्पिंडल कोशिकाएं 22, रूट सेल12,24, मैक्रोफेज 25, पेरिसाइट्स 26, और एंडोथेलियल कोशिकाएं 27, जिनमें आयनिक होमियोस्टैसिस और ईपी 28 की पीढ़ी से जुड़ी भूमिकाएं पूरी तरह से परिभाषित हैं।
थोक आरएनए-अनुक्रमण की तुलना में, एकल-नाभिक आरएनए-अनुक्रमण (एसएनयूसी-सेक) कोशिकाओं के समूह29 में एमआरएनए के औसत के बजाय सेल विषमता के बारे में जानकारी प्रदान करता है, और हेटरोजेनस एसवी30 का अध्ययन करते समय विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है। उदाहरण के लिए, sNuc-Seq ने ट्रांसक्रिप्शनल विश्लेषण का उत्पादन किया है जो बताता है कि ईपी पीढ़ी, सुनवाई हानि और मेनियर की बीमारी18 में स्पिंडल और रूट कोशिकाओं की भूमिका हो सकती है। विभिन्न एसवी सेल प्रकारों के आगे ट्रांसक्रिप्शनल लक्षण वर्णन हमें एसवी से संबंधित सुनवाई में उतार-चढ़ाव और सुनवाई हानि के विभिन्न तंत्रों और उपप्रकारों के अंतर्निहित पैथोफिज़ियोलॉजी पर अमूल्य जानकारी प्रदान कर सकते हैं। इन नाजुक आंतरिक कान संरचनाओं की फसल इष्टतम ऊतक विश्लेषण के लिए सर्वोपरि महत्व की है।
इस अध्ययन में, स्नुक-सेक या इम्यूनोस्टेनिंग के लिए वयस्क माउस कोक्लेया से स्ट्रिया संवहनी तक पहुंचने और अलग करने के लिए माइक्रोडिसेक्शन दृष्टिकोण का वर्णन किया गया है। वयस्क माउस एसवी का विच्छेदन विभिन्न एसवी सेल प्रकारों को समझने और सुनवाई में उनकी भूमिका को और चिह्नित करने के लिए आवश्यक है।
Protocol
Representative Results
Discussion
एकल-कोशिका अनुक्रमण के आगमन से पहले, कई शोधकर्ताओं ने थोक ऊतक विश्लेषण का उपयोग किया, जिसने केवल कोशिकाओं में औसत ट्रांसक्रिपटम्स का विश्लेषण करना संभव बना दिया। विशेष रूप से, एकल-कोशिका और स्नुक-सेक न?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को एनआईएच, एनआईडीसीडी के इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम द्वारा एमएच (DC000088) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 10-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50010-01 | Filter tissue during sNuc-Seq |
| 18 x 18 mm cover glass | Fisher Scientific | 12-541A | Cover slip to mount SV |
| 30-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50030-03 | Filter tissue during sNuc-Seq |
| 75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide | Daigger | EF15978Z | Microslide to mount SV on |
| C57BL/6J Mice | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:000664 | General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV. |
| Cell Counter | Logos Biosystems | L20001 | Used for cell counting |
| Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mm | Biomedical Research Instruments | 15-1020 | Used to transfer SV |
| Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1 | Chromium | PN-1000141 | Generates single cell 3' gene expression libraries |
| Clear nail polish | Fisher Scientific | NC1849418 | Used for sealing SV mount |
| Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well | Corning | 08-772B | Culture dish used to hold specimen during dissection |
| DAPI | Invitrogen | D1306, RRID: AB_2629482 | Stain used for nucleus labeling |
| Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D8938 | Used to homogenize tissue for sNuc-seq |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | General forceps for dissection |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Glue stick | Fisher Scientific | NC0691392 | Used for mounting SV |
| GS-IB4 Antibody | Molecular Probes | I21411, RRID: AB-2314662 | Antibody used for capillary labeling |
| KCNJ10-ZsGreen Mice | n/a | n/a | Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV. |
| MgCl2 | ThermoFisher | AM9530G | Used for steps of sNuc-Seq |
| Mounting reagent | ThermoFisher | #S36940 | Mounting reagent for SV |
| Multiwell 24 well plate | Corning | #353047 | Plate used for immunostaining |
| NaCl | ThermoFisher | AAJ216183 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Nonidet P40 | Sigma-Aldrich | 9-16-45-9 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Nuclease free water | ThermoFisher | 4387936 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Orbital shaker | Silent Shake | SYC-2102A | Used for steps of immunostaining |
| PBS | ThermoFisher | J61196.AP | Used for steps of immunostaining and dissection |
| RNA Later | Invitrogen | AM7021 | Used for preservation of SV for sNuc-Seq |
| Scizzors | Fine Science Tools | 14058-09 | Used for splitting mouse skull |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 15506017 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Trypan blue stain | Gibco | 15250061 | Used for cell counting |
| Tween20 | ThermoFisher | AAJ20605AP | Used for steps of sNuc-Seq |
| Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope | Zeiss | n/a | Microscope used for dissections |
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