Este protocolo descreve um modelo neonatal de circulação extracorpórea (CEC), com parada circulatória e cardíaca como ferramenta para o estudo de danos cerebrais graves e outras complicações secundárias à CEC.
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Artigo de método
Modelo Animal Pediátrico de Ressuscitação Cardiopulmonar Extracorpórea Após Parada Circulatória Prolongada
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Neste artigo
Resumo
Resumo
A cardiopatia congênita (DCC) é a malformação congênita mais prevalente, com cerca de um milhão de nascimentos impactados em todo o mundo por ano. A investigação abrangente desta doença requer modelos animais apropriados e validados. Os leitões são comumente usados para pesquisa translacional devido à sua anatomia e fisiologia análogas. Este trabalho teve como objetivo descrever e validar um modelo de circulação extracorpórea (CEC) em leitões neonatais com parada circulatória e cardíaca (PCR) como ferramenta para o estudo de danos cerebrais graves e outras complicações da cirurgia cardíaca. Além de incluir uma lista de materiais, este trabalho fornece um roteiro para outros investigadores planejarem e executarem este protocolo. Depois que profissionais experientes realizaram vários ensaios, os resultados representativos do modelo demonstraram uma taxa de sucesso de 92%, com falhas atribuídas ao pequeno tamanho do leitão e à anatomia variante do vaso. Além disso, o modelo permitiu que os profissionais selecionassem entre uma ampla variedade de condições experimentais, incluindo tempos variados em AC, alterações de temperatura e intervenções farmacológicas. Em resumo, esse método usa materiais prontamente disponíveis na maioria dos ambientes hospitalares, é confiável e reprodutível e pode ser amplamente empregado para aprimorar a pesquisa translacional em crianças submetidas a cirurgia cardíaca.
Introdução
A cardiopatia congênita (CC) é a malformação congênita mais prevalente, com cerca de um milhão de nascimentos impactados em todo o mundo por ano1. Embora os avanços modernos na cirurgia cardiotorácica (STC) e no tratamento intensivo tenham melhorado as taxas de mortalidade, as comorbidades permanecem extremamente comuns 2,3,4,5. Anormalidades do neurodesenvolvimento, incluindo deficiências cognitivas e motoras, bem como dificuldades de aprendizagem, são relatadas em cerca de 25% a 50% desses pacientes 6,7,8. A cirurgia nos primeiros dias de vida, especialmente aquelas que requerem parada circulatória e cardíaca (PCR), demonstrou aumentar a morbidade9. Alterações hemodinâmicas durante a cirurgia podem ter um efeito importante no cérebro vulnerável do recém-nascido em desenvolvimento. Modelos experimentais são essenciais para entender melhor a origem dessas anormalidades e investigar estratégias neuroprotetoras para melhorar o prognóstico desses pacientes.
O uso de modelos animais para estudar essa população tem sido amplamente documentado 5,10,11,12,13,14. Notavelmente, os leitões oferecem uma excelente opção, dadas as aproximações na anatomia cardíaca (Figura 1), genoma e fisiologia, bem como seu tamanho relativamente maior em comparação com outros modelos animais15 (Figura 2). O uso de modelos de leitões para estudar os efeitos da circulação extracorpórea (CEC) e da AC foi descrito anteriormente. Esses modelos animais experimentais são úteis para estudar alterações hemodinâmicas e complicações associadas em órgãos de tecido-alvo 14,16,17,18,19,20. Esses modelos foram desenvolvidos para permitir que os pesquisadores estudem as condições humanas em um ambiente controlado, com flexibilidade para uma variedade de condições experimentais. A maioria dos estudos relata o uso da canulação central, técnica que exige habilidades cirúrgicas avançadas, requer maior utilização de recursos e dificulta a garantia de sobrevida em longo prazo. Embora estudos anteriores tenham documentado o uso de leitões no estudo da CEC12,15, poucos propuseram a técnica de canulação periférica.
Essa nova técnica de canulação periférica é mais fácil, menos agressiva e mais viável quando comparada a outros estudospublicados19. Além disso, a validação dessa técnica em recém-nascidos e pequenos animais é nova e deve ser considerada para uso por todos os pesquisadores interessados em usar um modelo animal para estudar CC e suas comorbidades associadas. É particularmente apropriado para indivíduos com acesso a um laboratório equipado com suprimentos, recursos e pessoal experiente na realização de experimentos com modelos animais.
Em resumo, o objetivo principal deste estudo é descrever e validar um modelo de leitões neonatais de CEC com AC. O protocolo visa estudar danos cerebrais graves e outras possíveis complicações da cirurgia de CEC em um ambiente controlado com condições experimentais variadas. Este método fornece um modelo generalizável, confiável e de alta qualidade, que pode ser usado para uma ampla variedade de protocolos experimentais.
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Protocolo
O presente procedimento foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CEEA) do Centro de Medicina Comparada e Bioimagem da Catalunha (CEEA-CMCiB). O Governo da Catalunha também autorizou o protocolo experimental (nº 11652), número de identificação do arquivo FUE-2022-02381434 e ID QBXQ3RY3J. Profissionais experientes, incluindo veterinários certificados que fornecem supervisão e assistência, realizaram todos os experimentos. Leitões (Sus scrofa domestica), com 4-6 dias de idade, pesando 2,5-3,5 kg, foram utilizados para o presente estudo. Foi feita uma tentativa de equilibrar a distribuição de gênero para evitar vieses relacionados.
1. Sedação, intubação e acesso
- Inicie a sedação e analgesia com cetamina intramuscular (20 mg / kg), dexmedetomidina (0,02 mg / kg) e midazolam (0,3 mg / kg). Uma vez que o animal esteja profundamente sedado (5 minutos após a administração da pré-medicação), oxigenar com 100% O2 através de uma máscara de focinho (2 L/min). Em seguida, induza a anestesia com propofol IV (0,5 mg / kg) (ver Tabela de Materiais).
- Posicione o leitão na posição de decúbito dorsal. Realize a intubação orotraqueal usando um tubo endotraqueal com balonete de 2,5 mm (consulte a Tabela de Materiais), usando visualização direta da traqueia.
- Confirme a colocação apropriada do tubo endotraqueal por meio da ausculta direta das bases pulmonares.
- Defina a ventilação mecânica para fornecer uma frequência respiratória de 30 respirações por minuto, um volume corrente de 8-12 mL/kg e uma pressão expiratória final de 4 cmH2O.
- Monitore continuamente a profundidade da anestesia durante o protocolo por meio da frequência cardíaca (FC), pressão arterial (PA) e saturação de oxigênio (spO2). Ajuste os parâmetros ventilatórios e de sedação conforme necessário.
NOTA: Os valores ideais para os sinais vitais são FC de 130-160 bpm, PA de 75-95/60-70 e spO2 > 85. - Mantenha a sedação com sevoflurano e fentanil a 1,5% (25-200 μg/kg/min) (ver Tabela de Materiais).
- Use a visualização direta para colocar cateteres na artéria femoral (3 Fr) e na veia (4 Fr) (ver Tabela de Materiais).
NOTA: Esses cateteres serão usados para administração de medicamentos e aquisição de amostras. Como tal, é importante manter o acesso.
2. Configuração e preparação do circuito CPB
- Personalize e configure o circuito de PCB seguindo as etapas abaixo (Figura 3):
- Encurte o tubo o máximo possível, deixando distância suficiente para alcançar o animal da máquina.
- Crie e conecte uma ponte de tubulação que conecte o fluxo de saída do oxigenador de membrana (consulte a Tabela de Materiais) ao fluxo de entrada na bomba.
NOTA: A ponte é vital para permitir que o sangue continue circulando pela máquina enquanto os CAs do animal estão sendo realizados.
- Uma vez que todos os pontos de conexão estejam selados, prepare o circuito com 300 mL de uma solução salina de heparina (1.000 UI de heparina misturada em 1 L de solução salina) e 300 mL de sangue de porco doador fresco, seguido por 3,5 mEq de bicarbonato de sódio, 350 UI de heparina e 450 mg de gluconato de cálcio (ver Tabela de Materiais).
- "Varra" o circuito passando a mistura de sangue, heparina-salina, bicarbonato de sódio e gluconato de cálcio por todo o circuito por 2 minutos a uma taxa de 0,3 L/min.
3. Cirurgia e início da CEC
NOTA: A Figura 1 suplementar mostra os materiais cirúrgicos necessários para a colocação da cânula.
- Expor a veia jugular interna esquerda e a artéria carótida direita para preparar a canulação (Figura 4).
- Para a canulação, utilizar a técnica de Seldinger ou "over-the-wire"21.
- Primeiro, insira um cateter de agulha na veia jugular interna esquerda. Assim que um flash de sangue for visualizado, insira cuidadosamente um fio-guia no vaso e remova a agulha, garantindo que o fio permaneça no lugar.
- Passe um dilatador sobre o fio e no vaso e, em seguida, remova o dilatador.
- Com o fio ainda no lugar, enfie uma cânula venosa de 8 Fr e avance-a lentamente ~4 cm para dentro do vaso. Remova cuidadosamente o fio, garantindo que a cânula permaneça no lugar.
- Repita a técnica do fio de Seldinger com dilatação para colocar uma cânula arterial pediátrica de 6 Fr (ver Tabela de Materiais) na artéria carótida direita.
- No momento da canulação arterial, administre um bolus de heparina intravenosa (50 UI/kg) através da cânula arterial recém-colocada.
- Uma vez obtido o acesso, fixe com segurança ambas as cânulas ao animal usando suturas poliabsorvíveis 3-0 e fita adesiva para evitar a remoção inadvertida (Figura 5).
- Conecte as cânulas ao circuito de CEC, garantindo que solução salina com heparina seja adicionada aos pontos de conexão para evitar a entrada de ar no circuito.
- Defina o fluxo inicial para 80-85 mL / kg / min e aumente-o lentamente para uma taxa de fluxo final de 150 mL / kg / min.
NOTA: O animal pode permanecer na CEC pelo tempo que os experimentos exigirem. Um esquema das etapas 1 a 3 é representado na Figura Suplementar 2.
4. Parada circulatória e cardíaca (CA)
- Para induzir CA, administre 9 mEq de KCl. Use sinais vitais para avaliar a parada completa e confirme com ecocardiografia. Administre KCl adicional conforme necessário.
- Uma vez que o coração esteja parado, isole o animal do circuito para induzir a parada circulatória.
- Mantenha o fluxo do circuito de CEC usando a ponte descrita anteriormente (etapa 3.5) circulando a 1.500 rpm.
5. Ressuscitação cardiopulmonar extracorpórea (eCPR)
- Assim que a condição de AC apropriada (0 min, 30 min ou 60 min) for alcançada, inicie a ressuscitação com eCPR.
- Reconecte o leitão ao circuito de CEC.
- Administrar 3 mL de gluconato de cálcio (2,25 mmol/10 mL, diluído 1:2) e 6 mL de bicarbonato de sódio (1 M, diluído 1:2) via acesso arterial periférico, adicionando doses conforme necessário.
NOTA: Cardioversão ou drogas inotrópicas (adrenalina ou dopamina) podem ser usadas, se necessário.
6. Cuidados pós-operatórios
- Uma vez ressuscitado, monitore os sinais vitais por 15 minutos para garantir a estabilidade.
NOTA: Os parâmetros ideais no período da unidade de terapia intensiva são: FC de 100-150 bpm, PA de 75-95/60-70 e spO2 > 85. - Transfira os animais para ressonância magnética (MRI).
NOTA: Após a imagem, os animais nunca se recuperaram e foram sacrificados sob anestesia por meio da administração intravenosa de pentobarbital sódico para obtenção de amostras cerebrais para análise histológica. Uma linha do tempo da parte experimental do procedimento, incluindo a estratégia de coleta de amostras, pode ser visualizada na Figura Suplementar 3.
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Resultados
Durante um período de 6 meses, o protocolo completo foi realizado 12 vezes por uma equipe interdisciplinar de médicos intensivistas pediátricos, cardiologistas pediátricos, veterinários e técnicos (Figura Suplementar 2 e Figura Suplementar 3).
A Figura 1 e a Figura 2 demonstram a anatomia esperada dos animais utilizados neste protocolo. Os leitões incluídos tinham em média 4,8 dias de idade (4-6 dias)...
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Discussão
A circulação extracorpórea é comumente usada durante a cirurgia cardíaca para adultos, crianças e neonatos. Ele conta com um circuito extracorpóreo motorizado e um oxigenador de membrana que trabalham juntos para oxigenar o sangue e fornecer estabilização pulmonar e cardíaca. Estudos anteriores demonstraram que a CEC pode afetar adversamente muitos sistemas de órgãos (renal, cerebral, pulmonar, cardíaco, gastrointestinal) tanto em pacientes doentes quanto em pacientes previamente saudáveis 22,23,2...
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este projeto recebeu financiamento do programa de pesquisa e inovação Horizonte 2020 da União Europeia sob o acordo de subvenção nº 101017113, do Instituto de Salud Carlos III (PI20/00298), da Beca Carmen de Torres (Fundació Sant Joan de Déu) e do Vanderbilt Medical Scholars Program. Agradecemos a todos os funcionários do CMCiB, incluindo Jordi Grifols, María del Mar Arevalo, Juan Ricardo Gonzalez, Sara Capdevila, Josep Puig e Gemma Cristina Monte Rubi). Também agradecemos especialmente a Abril Culell Camprubí e ao Dr. Sergi Cesar Díaz por sua ajuda nos desenhos anatômicos.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1,5% sevofluorano | Zoetis | 20070289 | |
| tubo endotraqueal de 2,5 mm | Henry Schein | 988-1782 | |
| Cateter de 3 Fr para acesso arterial periférico | Prodimed | 3872.1 | |
| Cateter de 4 Fr para acesso venoso periférico | Prodimed | 3872.13 | |
| 6 Cânula arterial pediátrica de ECMO francesa | Medtronic | 77206 | |
| 8 Cânula venosa pediátrica ECMO francesa | Medtronic | 68112 | |
| Adrenaline | B Braun | 469801-1119 | |
| Pinça Adson | Instrumentos Allgaier | 08-030-130 | Qualquer marca pode ser substituída pelo |
| manguito BP | Mindray | ||
| Buprenorfina (0,01 mg/kg) | Richter Pharma | #9004114000537 | |
| Gluconato de cálcio (2,25 mmol/10 mL) | B Braun | 570-12606194-1119 | |
| Dexmedetomidina (0,5-2,0 µ g/kg/min) | Orion farma | GTN 064321000017253 | |
| Doletol | vetoquinol | #3605870004904 | |
| Dopamina | hikma | A044098010 | |
| Fentanil (25-200 µ g/kg/min) | Kern Pharma | 756650.2H | |
| Sangue de porco doador fresco Tipo O | Qualquer | ||
| Trocador de calor | Maquet Gmbh & Co | MCP70107.2130 | |
| Heparina (1350 UI) | ROVI | 641641.1 | |
| Afastador Irwin | Aesculap | BV104R | Qualquer marca pode ser substituída |
| Cetamina (20 mg/kg) | Lubrificante Richter Pharma | #9004114000452 | |
| orotraqueal | |||
| Midazolam (0,3 mg/kg) | Serra Pamies | 619627.4 | |
| Pinça de mosquito | Aesculap | BH109R | Qualquer marca pode ser substituída |
| Pinça de agulha | Aesculap | BM016R | Qualquer marca pode ser substituída |
| Normal solução salina (0,9%) | B Braun Fisiovet | 5/469827/0610 | Qualquer marca pode ser substituída |
| Grampos de plástico para tubulação | Achim Schulz-Lauterbach | DBGM | Qualquer marca pode ser substituída |
| Cloreto de potássio (9 mEq) | B Braun | 3545156 | |
| Propofol (0,5 mg/kg) | Zoetis | 579742.7 | |
| Oxigenador de Membrana Quadrox | Maquet Gmbh & Co | BE-HMOSD 300000 | |
| Termômetro retal | Qualquer | ||
| console RotaFlow Sistema ECMO | Maquet Gmbh & Co | MCP00703177 | Sistema de ECMO Neonatal |
| Bisturi | Aesculap | BB074R | Qualquer marca pode ser substituída |
| Bicarbonato de sódio (1 M) | Fresenius Kabi | 634477.4 OH | |
| Tesoura cirúrgica | Talmed Inox | 112 | Qualquer marca pode ser substituída Sutura |
| (3/0 poli absorvível) | B Braun Novosyn (R) | 0068030N1 | Qualquer marca pode ser substituída |
Referências
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Reimpressões e permissões
