Imagerie par immunofluorescence des pièges extracellulaires des neutrophiles dans les tissus humains et murins

Summary

Les pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) sont associés à diverses maladies, et l’immunofluorescence est souvent utilisée pour leur visualisation. Cependant, il existe différents protocoles de coloration et, dans de nombreux cas, un seul type de tissu est examiné. Ici, nous établissons un protocole d’application générale pour la coloration des TNE dans les tissus de souris et d’humains.

Abstract

Les pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) sont libérés par les neutrophiles en réponse à une infection bactérienne ou à une lésion traumatique des tissus, mais jouent également un rôle dans les maladies auto-immunes et l’inflammation stérile. Ce sont des structures en forme de toile composées de filaments d’ADN double brin, d’histones et de protéines antimicrobiennes. Une fois libérées, les TNE peuvent piéger et tuer les agents pathogènes extracellulaires dans le sang et les tissus. De plus, les TNE participent à la régulation homéostatique en stimulant l’adhésion plaquettaire et la coagulation. Cependant, la production déréglée de TNE a également été associée à diverses maladies, notamment la septicémie ou les maladies auto-immunes, ce qui en fait une cible prometteuse pour une intervention thérapeutique. Outre la microscopie électronique, la visualisation des TNE à l’aide de l’imagerie par immunofluorescence est actuellement l’une des seules méthodes connues pour démontrer les interactions TNE dans les tissus. Par conséquent, diverses méthodes de coloration ont été utilisées pour visualiser les TNE. Dans la littérature, différents protocoles de coloration sont décrits, et nous avons identifié quatre composantes clés présentant une grande variabilité entre les protocoles : (1) les types d’anticorps utilisés, (2) l’utilisation d’agents autoréducteurs, (3) les méthodes de récupération d’antigènes, et (4) la perméabilisation. Par conséquent, les protocoles de coloration par immunofluorescence in vitro ont été systématiquement adaptés et améliorés dans ce travail pour les rendre applicables à différentes espèces (souris, humains) et tissus (peau, intestin, poumon, foie, cœur, disque vertébral). Après la fixation et l’enrobage de paraffine, des profilés de 3 μm d’épaisseur ont été montés sur des lames. Ces échantillons ont été colorés avec des anticorps primaires contre la myéloperoxydase (MPO), l’histone H3 citrullinée (H3cit) et l’élastase neutrophile (NE) selon un protocole de coloration modifié. Les lames ont été colorées avec des anticorps secondaires et examinées à l’aide d’un microscope à fluorescence à grand champ. Les résultats ont été analysés à l’aide d’une fiche d’évaluation et les différences ont été enregistrées de manière semi-quantitative.

Nous présentons ici un protocole de coloration NET optimisé adapté à différents tissus. Nous avons utilisé un nouvel anticorps primaire pour colorer H3cit et réduit la coloration non spécifique avec un agent autoréducteur. De plus, nous avons démontré que la coloration NET nécessite une température élevée constante et une manipulation soigneuse des échantillons.

Introduction

Les pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) ont été visualisés pour la première fois par Brinkmann et al. comme une voie de mort cellulaire différente de l’apoptose et de la nécrose en 2004¹. Dans cette voie, les neutrophiles libèrent leur chromatine décondensée dans l’espace extracellulaire pour former de grandes structures en forme de toile recouvertes de protéines antimicrobiennes qui étaient auparavant stockées dans les granules ou le cytosol. Ces protéines antimicrobiennes comprennent l’élastase neutrophile (NE), la myéloperoxydase (MPO) et l’histone citrullinée H3 (H3cit), qui sont couramment utilisées pour la détection indirecte par immunofluorescence des TNE². Cette méthode permet non seulement d’identifier la présence quantitative de ces protéines ; en effet, il a l’avantage de détecter spécifiquement les structures de type NET. Dans les TNE, les protéines mentionnées co-localisent avec l’ADN extracellulaire, qui peut être détecté par un chevauchement des signaux de fluorescence de chaque protéine colorée et de l’ADN extracellulaire. Contrairement aux signaux qui se chevauchent en raison de la co-localisation de l’ADN extracellulaire et des protéines dans les TNE, les neutrophiles intacts ne présentent aucune co-localisation. Ici, les composants NET sont généralement stockés séparément dans les granulés, les noyaux et le cytosol³.

Depuis leur première découverte, il a été démontré que les TNE jouent un rôle central dans de nombreuses maladies, en particulier celles impliquant une inflammation. Les TNE montrent des fonctions antimicrobiennes pendant l’infection en piégeant et en tuant les agents pathogènes extracellulaires dans le sang et les tissus ^4,5. Cependant, les TNE ont également été associées à des maladies auto-immunes et à des réponses hyperinflammatoires, comme le lupus érythémateux disséminé, l’arthrite rhumatismale et l’asthme allergique ^6,7,8. Les TNE favorisent la vaso-occlusion et l’inflammation dans l’athérosclérose, l’adhésion plaquettaire, et on suppose qu’elles jouent un rôle dans le cancer métastatique 9,10,11. Néanmoins, on pense qu’ils ont des propriétés anti-inflammatoires en réduisant les niveaux de cytokines pro-inflammatoires¹². Alors que les TNE suscitent de plus en plus d’intérêt dans un domaine de recherche plus large, une méthode robuste de détection des TNE est fondamentale pour les recherches futures.

Même si la visualisation des TNE dans différents tissus à l’aide de l’imagerie par immunofluorescence est complexe et nécessite une personnalisation, en dehors de la microscopie électronique, elle est actuellement l’une des méthodes les plus connues pour visualiser les interactions entre les TNE et les cellules et est principalement utilisée dans les tissus enrobés de paraffine fixés au formol (FFPE)^13,14. Cependant, il est difficile de comparer l’imagerie NET, car différents laboratoires utilisent leurs propres protocoles personnalisés. Ces protocoles diffèrent par leur utilisation d’anticorps, de prélèvement d’antigènes ou de méthode de perméabilisation et sont souvent optimisés pour un type spécifique de tissu 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ^,27.

Après que Brinkmann et al. aient publié la première étude méthodique utilisant la visualisation immunofluorescente des TNE dans les tissus FFPE, nous avons voulu optimiser ce protocole pour une plus grande variété de tissus et d’espèces¹⁵. De plus, afin d’établir un protocole d’immunofluorescence largement applicable, nous avons testé différents protocoles modifiés d’études utilisant des méthodes d’immunofluorescence dans des tissus FFPE pour détecter les TNE 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25^{, 26 et 27}. De plus, nous avons essayé un nouvel anticorps H3cit pour une coloration extracellulaire plus spécifique²⁸. Nous émettons l’hypothèse qu’en adaptant systématiquement les protocoles de coloration actuels à différentes espèces et tissus, l’imagerie in vitro peut être améliorée, ce qui se traduit par une meilleure représentation de l’interaction entre les neutrophiles et les TNE à la fois localement et systémiquement.

Protocol

Cette étude a inclus des tissus de souris provenant d’expériences approuvées par l’Administration d’État de Hambourg pour la recherche animale, Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, Hambourg, Allemagne (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). Les tissus utilisés étaient des poumons et du côlon de souris provenant d’un modèle septique et de peau brûlée. Nous avons utilisé des souris mâles et femelles âgées de 8 semaines. La directive européenne 2010/63/UE relative à la protection des animaux …

Representative Results

Avant de commencer l’optimisation de notre protocole, nous avons identifié les étapes clés d’une coloration réussie en recherchant dans PubMed des études utilisant des tissus FFPE pour l’immunomarquage des TNE et en comparant leurs protocoles. Les différences de protocole les plus prometteuses ont été identifiées comme les étapes clés de l’optimisation du protocole, tandis que les étapes qui correspondaient pour la plupart les unes aux autres n’ont pas été modifiées (tableau 1).<…

Discussion

Dans ce travail, nous avons cherché à adapter et à optimiser les protocoles existants pour l’imagerie des TNE à un plus grand nombre de types de tissus, en commençant par le processus de coloration proprement dit. La première étape critique de cette méthode est la sélection des anticorps les plus appropriés. Pour l’EN, nous avons testé un anticorps anti-NE provenant d’un hôte de souris sur des tissus humains, qui n’a montré aucune coloration fiable par rapport à l’EN, provenant d’un hôte lapin….

Materials

			Dilution
Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µg	abcam	Ab 68672	1:100
Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody  100µg	abcam	Ab 5103	1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µg	abcam	Ab 25989	1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µg	abcam	Ab 90810	1:50
Axiovision Microscopy Software	Zeiss	4.8.2.
Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml	GeneTex	GTX30972
Coverslips	Marienfeld	0101202
Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10)	Dako	S2369
DAPI 25 mg	Roth	6335.1	1:25000
DCS antibody dilution 500 mL	DCS diagnostics	DCS AL120R500
Donkey ant goat Cy3	JacksonImmunoResearch	705-165-147	1:200
Donkey anti rabbit AF647	JacksonImmunoResearch	711-605-152	1:200
Donkey anti rabbit Cy3	JacksonImmunoResearch	711-165-152	1:200
Fluoromount-G Mounting Medium	Invitrogen	00-4958-02
Glass slide rack	Roth	H552.1
Human/Mouse MPO Antibody	R&D Systems	AF 3667	1:20
Hydrophobic Pen	KISKER	MKP-1
Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg	abcam	Ab 37415	1:2000 and 1:250
MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml	Maxvision	MB-L
Microscopy camera	Zeiss	AxioCamHR3
Microwave	Bosch	HMT84M421
Mouse IgG1 negative control	Dako	X0931 Aglient	1:50 and 1:5
Normal Goat IgG Control	R&D Systems	AB-108-C	1:100
PBS Phosphate buffered saline (10x)	Sigma-Aldrich	P-3813
PMP staining jar	Roth	2292.2
Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µg	abcam	Ab 219406	1:100
Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] – Isotype Control 200µg	abcam	Ab 172730	1:300
ROTI Histol	Roth	6640
SuperFrost Plus slides	R. Langenbrinck	03-0060
TBS Tris buffered saline (x10)	Sigma-Aldrich	T1503
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Water bath	Memmert	830476
Water bath rice cooker	reishunger	RCP-30
Wet chamber	Weckert Labortechnik	600016
Zeiss Widefield microscope	Zeiss	Axiovert 200M