Immunfluorescensavbildning av nøytrofile ekstracellulære feller i vev fra mennesker og mus
Summary
Neutrofile ekstracellulære feller (NET) er forbundet med ulike sykdommer, og immunfluorescens brukes ofte til visualisering. Imidlertid er det forskjellige fargeprotokoller, og i mange tilfeller undersøkes bare en type vev. Her etablerer vi en generelt anvendelig protokoll for farging av NET i mus og humant vev.
Abstract
Neutrofile ekstracellulære feller (NET) frigjøres av nøytrofiler som et svar på bakteriell infeksjon eller traumatisk vevskader, men spiller også en rolle i autoimmune sykdommer og steril betennelse. De er nettlignende strukturer sammensatt av dobbeltstrengede DNA-filamenter, histoner og antimikrobielle proteiner. Når de er utgitt, kan NET fange og drepe ekstracellulære patogener i blod og vev. Videre deltar NET i homeostatisk regulering ved å stimulere blodplateadhesjon og koagulasjon. Imidlertid har den dysregulerte produksjonen av NET også vært assosiert med ulike sykdommer, inkludert sepsis eller autoimmune lidelser, noe som gjør dem til et lovende mål for terapeutisk inngrep. Bortsett fra elektronmikroskopi, er visualisering av NET ved hjelp av immunfluorescensavbildning for tiden en av de eneste kjente metodene for å demonstrere NET-interaksjoner i vev. Derfor har ulike fargemetoder for å visualisere NET blitt benyttet. I litteraturen er forskjellige fargeprotokoller beskrevet, og vi identifiserte fire nøkkelkomponenter som viser høy variabilitet mellom protokoller: (1) hvilke typer antistoffer som brukes, (2) bruk av autofluorescensreduserende midler, (3) antigenuthentingsmetoder og (4) permeabilisering. Derfor ble in vitro immunfluorescensfargeprotokoller systematisk tilpasset og forbedret i dette arbeidet for å gjøre dem anvendelige for forskjellige arter (mus, menneske) og vev (hud, tarm, lunge, lever, hjerte, ryggskive). Etter fiksering og parafininnstøping ble 3 μm tykke seksjoner montert på lysbilder. Disse prøvene ble farget med primære antistoffer for myeloperoksidase (MPO), citrullinert histon H3 (H3cit) og nøytrofil elastase (NE) i henhold til en modifisert fargeprotokoll. Lysbildene ble farget med sekundære antistoffer og undersøkt med et bredfeltfluorescensmikroskop. Resultatene ble analysert i henhold til et evalueringsark, og forskjellene ble registrert semi-kvantitativt.
Her presenterer vi en optimalisert NET-fargeprotokoll som passer for forskjellige vev. Vi brukte et nytt primært antistoff for å flekke for H3cit og reduserte uspesifikk farging med et autofluorescensreduserende middel. Videre demonstrerte vi at NET-farging krever konstant høy temperatur og forsiktig håndtering av prøver.
Introduction
Nøytrofile ekstracellulære feller (NET) ble først visualisert av Brinkmann et al. som en vei for cellulær død forskjellig fra apoptose og nekrose i 20041. I denne banen frigjør nøytrofiler deres dekondenserte kromatin i det ekstracellulære rommet for å danne store nettlignende strukturer dekket av antimikrobielle proteiner som tidligere ble lagret i granulatene eller cytosolen. Disse antimikrobielle proteinene inkluderer nøytrofil elastase (NE), myeloperoksidase (MPO) og citrullinert histon H3 (H3cit), som ofte brukes til indirekte immunfluorescensdeteksjon av NET2. Denne metoden identifiserer ikke bare den kvantitative tilstedeværelsen av disse proteinene; faktisk har den fordelen av å spesifikt oppdage NET-lignende strukturer. I NET lokaliseres de nevnte proteiner sammen med ekstracellulært DNA, som kan detekteres ved en overlapping av fluorescenssignalene til hvert farget protein og det ekstracellulære DNA. I motsetning til de overlappende signalene på grunn av ekstracellulær DNA- og protein-samlokalisering i NET, viser intakte nøytrofiler ingen samlokalisering. Her lagres NET-komponentene vanligvis separat i granulatene, kjernene og cytosol3.
Siden deres første oppdagelse har det vist seg at NET spiller en sentral rolle i mange sykdommer, spesielt de som involverer betennelse. NET viser antimikrobielle funksjoner under infeksjon gjennom fangst og drap av ekstracellulære patogener i blod og vev 4,5. Imidlertid har NET også vært knyttet til autoimmune sykdommer og hyperinflammatoriske responser, som systemisk lupus erythematosus, revmatisk artritt og allergisk astma 6,7,8. NET fremmer vaso-okklusjon og betennelse i aterosklerose, blodplateadhesjon, og spekuleres i å spille en rolle i metastatisk kreft 9,10,11. Likevel antas de å ha antiinflammatoriske egenskaper ved å redusere proinflammatoriske cytokinnivåer12. Mens NET får mer interesse for et bredere forskningsfelt, er en robust NET-deteksjonsmetode grunnleggende for fremtidig forskning.
Selv om visualisering av NET i forskjellige vev ved hjelp av immunfluorescensavbildning er kompleks og krever tilpasning, bortsett fra elektronmikroskopi, er det for tiden en av de mest anerkjente metodene for å visualisere interaksjonene mellom NET og celler, og brukes hovedsakelig i formalinfast parafininnebygd vev (FFPE)13,14. Det er imidlertid vanskelig å sammenligne NET-bildebehandling, da forskjellige laboratorier bruker sine egne tilpassede protokoller. Disse protokollene varierer i bruk av antistoffer, antigengjenfinning eller permeabiliseringsmetode og er ofte optimalisert for en bestemt type vev 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ,27.
Etter at Brinkmann et al. publiserte den første metodiske studien ved hjelp av immunfluorescerende visualisering av NET i FFPE-vev, ønsket vi å optimalisere denne protokollen for et bredere utvalg av vev og arter15. I tillegg, for å etablere en bredt anvendelig immunfluorescensprotokoll, testet vi forskjellige modifiserte protokoller fra studier som brukte immunfluorescensmetoder i FFPE-vev for å oppdage NET 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. Videre prøvde vi et nytt H3cit-antistoff for mer spesifikk ekstracellulær farging28. Vi hypoteser at ved systematisk å tilpasse nåværende fargeprotokoller til forskjellige arter og vev, kan in vitro-avbildning forbedres, noe som resulterer i en bedre representasjon av samspillet mellom nøytrofiler og NET både lokalt og systemisk.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dette arbeidet hadde vi som mål å tilpasse og optimalisere de eksisterende protokollene for avbildning av NET til flere vevstyper, og begynte med selve fargeprosessen. Det første kritiske trinnet for denne metoden er valget av de mest egnede antistoffene. For NE prøvde vi et NE-antistoff fra en musevert på humant vev, som ikke viste noen pålitelig farging sammenlignet med NE fra en kaninvert. Videre foreslo Thålin et al. H3cit (R8) som et mer spesifikt antistoff for ekstracellulær farging. Vi sammenlignet dette…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble grunnlagt av det tyske forskningsselskapet (BO5534). Vi takker Antonia Kiwitt, Moritz Lenz, Johanna Hagens, Dr. Annika Heuer og PD Dr. Ingo Königs for å gi oss prøver. I tillegg takker forfatterne teamet fra UKE Microscopy Imaging Facility (Core facility, UKE Medical School) for støtte med immunfluorescensmikroskopien.
Materials
| Dilution | |||
| Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µg | abcam | Ab 68672 | 1:100 |
| Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody 100µg | abcam | Ab 5103 | 1:50 |
| Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µg | abcam | Ab 25989 | 1:50 |
| Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µg | abcam | Ab 90810 | 1:50 |
| Axiovision Microscopy Software | Zeiss | 4.8.2. | |
| Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml | GeneTex | GTX30972 | |
| Coverslips | Marienfeld | 0101202 | |
| Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10) | Dako | S2369 | |
| DAPI 25 mg | Roth | 6335.1 | 1:25000 |
| DCS antibody dilution 500 mL | DCS diagnostics | DCS AL120R500 | |
| Donkey ant goat Cy3 | JacksonImmunoResearch | 705-165-147 | 1:200 |
| Donkey anti rabbit AF647 | JacksonImmunoResearch | 711-605-152 | 1:200 |
| Donkey anti rabbit Cy3 | JacksonImmunoResearch | 711-165-152 | 1:200 |
| Fluoromount-G Mounting Medium | Invitrogen | 00-4958-02 | |
| Glass slide rack | Roth | H552.1 | |
| Human/Mouse MPO Antibody | R&D Systems | AF 3667 | 1:20 |
| Hydrophobic Pen | KISKER | MKP-1 | |
| Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg | abcam | Ab 37415 | 1:2000 and 1:250 |
| MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml | Maxvision | MB-L | |
| Microscopy camera | Zeiss | AxioCamHR3 | |
| Microwave | Bosch | HMT84M421 | |
| Mouse IgG1 negative control | Dako | X0931 Aglient | 1:50 and 1:5 |
| Normal Goat IgG Control | R&D Systems | AB-108-C | 1:100 |
| PBS Phosphate buffered saline (10x) | Sigma-Aldrich | P-3813 | |
| PMP staining jar | Roth | 2292.2 | |
| Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µg | abcam | Ab 219406 | 1:100 |
| Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] – Isotype Control 200µg | abcam | Ab 172730 | 1:300 |
| ROTI Histol | Roth | 6640 | |
| SuperFrost Plus slides | R. Langenbrinck | 03-0060 | |
| TBS Tris buffered saline (x10) | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Water bath | Memmert | 830476 | |
| Water bath rice cooker | reishunger | RCP-30 | |
| Wet chamber | Weckert Labortechnik | 600016 | |
| Zeiss Widefield microscope | Zeiss | Axiovert 200M |
Referências
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathogens. 5 (10), e1000639 (2009).
- Abu Abed, U., Brinkmann, V. Immunofluorescence labelling of human and murine neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded tissue. Journal of Visualized Experiments. (151), e60115 (2019).
- Kawasaki, H., Iwamuro, S. Potential roles of histones in host defense as antimicrobial agents. Infectious Disorders – Drug Targets. 8 (3), 195-205 (2008).
- Bianchi, M., Niemiec, M. J., Siler, U., Urban, C. F., Reichenbach, J. Restoration of anti-Aspergillus defense by neutrophil extracellular traps in human chronic granulomatous disease after gene therapy is calprotectin-dependent. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 127 (5), 1243-1252 (2011).
- Hakkim, A., et al. Impairment of neutrophil extracellular trap degradation is associated with lupus nephritis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (21), 9813-9818 (2010).
- Papadaki, G., et al. Neutrophil extracellular traps exacerbate Th1-mediated autoimmune responses in rheumatoid arthritis by promoting DC maturation. European Journal of Immunology. 46 (11), 2542-2554 (2016).
- Toussaint, M., et al. Host DNA released by NETosis promotes rhinovirus-induced type-2 allergic asthma exacerbation. Nature Medicine. 23 (6), 681-691 (2017).
- Fuchs, T. A., et al. Extracellular DNA traps promote thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15880-15885 (2010).
- Park, J., et al. Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps. Science Translational Medicine. 8 (361), (2016).
- Warnatsch, A., Ioannou, M., Wang, Q., Papayannopoulos, V. Inflammation. Neutrophil extracellular traps license macrophages for cytokine production in atherosclerosis. Science. 349 (6245), 316-320 (2015).
- Schauer, C., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps limit inflammation by degrading cytokines and chemokines. Nature Medicine. 20 (5), 511-517 (2014).
- Radermecker, C., Hego, A., Delvenne, P., Marichal, T. Identification and quantitation of neutrophil extracellular traps in human tissue sections. BioProtocol. 11 (18), e4159 (2021).
- de Buhr, N., von Köckritz-Blickwede, M. How neutrophil extracellular traps become visible. Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).
- Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in paraffin-embedded tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).
- Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).
- Santos, A., et al. NETs detection and quantification in paraffin embedded samples using confocal microscopy. Micron. 114, 1-7 (2018).
- Savchenko, A. S., et al. Neutrophil extracellular traps form predominantly during the organizing stage of human venous thromboembolism development. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (6), 860-870 (2014).
- O’Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).
- Barliya, T., et al. Possible involvement of NETosis in inflammatory processes in the eye: Evidence from a small cohort of patients. Molecular Vision. 23, 922-932 (2017).
- Xu, D., et al. Overproduced bone marrow neutrophils in collagen-induced arthritis are primed for NETosis: An ignored pathological cell involving inflammatory arthritis. Cell Proliferation. 53 (7), e12824 (2020).
- Nonokawa, M., et al. Association of neutrophil extracellular traps with the development of idiopathic osteonecrosis of the femoral head. American Journal of Pathology. 190 (11), 2282-2289 (2020).
- Tucker, S. L., Sarr, D., Rada, B. Neutrophil extracellular traps are present in the airways of ENaC-overexpressing mice with cystic fibrosis-like lung disease. BMC Immunology. 22 (1), 7 (2021).
- Knackstedt, S. L., et al. Neutrophil extracellular traps drive inflammatory pathogenesis in malaria. Science Immunology. 4 (40), (2019).
- Nakazawa, D., et al. Histones and neutrophil extracellular traps enhance tubular necrosis and remote organ injury in ischemic AKI. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (6), 1753-1768 (2017).
- Duler, L., Nguyen, N., Ontiveros, E., Li, R. H. L. Identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (157), e60834 (2020).
- Stehr, A. M., et al. Neutrophil extracellular traps drive epithelial-mesenchymal transition of human colon cancer. Journal of Pathology. 256 (4), 455-467 (2022).
- Thålin, C., et al. Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).
- Yamashita, S. Heat-induced antigen retrieval: Mechanisms and application to histochemistry. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
- Smyth, L., et al. Neutrophil-vascular interactions drive myeloperoxidase accumulation in the brain in Alzheimer’s disease. Acta Neuropathologica Communications. 10 (1), 38 (2022).
- Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 2-22 (2017).
- Nazir, S., Charlesworth, R. P. G., Moens, P., Gerber, P. F. Evaluation of autofluorescence quenching techniques on formalin-fixed chicken tissues. Journal of Immunological Methods. 496, 113097 (2021).
- Schneider, C., et al. IVIG regulates the survival of human but not mouse neutrophils. Scientific Reports. 7 (1), 1296 (2017).
- Risso, A. Leukocyte antimicrobial peptides: Multifunctional effector molecules of innate immunity. Journal of Leukocyte Biology. 68 (6), 785-792 (2000).
