Immunofluorescentiebeeldvorming van neutrofiele extracellulaire vallen in menselijke en muizenweefsels
Summary
Neutrofiele extracellulaire vallen (NET’s) worden in verband gebracht met verschillende ziekten en immunofluorescentie wordt vaak gebruikt voor hun visualisatie. Er zijn echter verschillende kleuringsprotocollen en in veel gevallen wordt slechts één type weefsel onderzocht. Hier stellen we een algemeen toepasbaar protocol op voor het kleuren van NET in muizen en menselijk weefsel.
Abstract
Neutrofiele extracellulaire vallen (NET’s) worden vrijgegeven door neutrofielen als reactie op bacteriële infectie of traumatische weefselschade, maar spelen ook een rol bij auto-immuunziekten en steriele ontstekingen. Het zijn webachtige structuren die zijn samengesteld uit dubbelstrengs DNA-filamenten, histonen en antimicrobiële eiwitten. Eenmaal vrijgegeven, kunnen NET’s extracellulaire ziekteverwekkers in bloed en weefsel vangen en doden. Bovendien nemen NET’s deel aan homeostatische regulatie door de adhesie en coagulatie van bloedplaatjes te stimuleren. De ontregelde productie van NET is echter ook in verband gebracht met verschillende ziekten, waaronder sepsis of auto-immuunziekten, waardoor ze een veelbelovend doelwit zijn voor therapeutische interventie. Afgezien van elektronenmicroscopie is het visualiseren van NET’s met behulp van immunofluorescentiebeeldvorming momenteel een van de weinige bekende methoden om NET-interacties in weefsel aan te tonen. Daarom zijn er verschillende kleuringsmethoden gebruikt om NET te visualiseren. In de literatuur worden verschillende kleuringsprotocollen beschreven en we hebben vier belangrijke componenten geïdentificeerd die een hoge variabiliteit tussen protocollen vertonen: (1) de gebruikte soorten antilichamen, (2) het gebruik van autofluorescentieverminderende middelen, (3) antigeenextractiemethoden en (4) permeabilisatie. Daarom werden in vitro immunofluorescentiekleuringsprotocollen de dit werk systemisch aangepast en verbeterd om ze toepasbaar te maken voor verschillende soorten (muis, mens) en weefsels (huid, darm, long, lever, hart, tussenwervelschijf). Na fixatie en paraffine-inbedding werden 3 μm dikke secties op objectglaasjes gemonteerd. Deze monsters werden gekleurd met primaire antilichamen voor myeloperoxidase (MPO), gecitrullineerd histon H3 (H3cit) en neutrofiele elastase (NE) volgens een gewijzigd kleuringsprotocol. De objectglaasjes werden gekleurd met secundaire antilichamen en onderzocht met behulp van een breedveldfluorescentiemicroscoop. De resultaten werden geanalyseerd volgens een evaluatieblad en de verschillen werden semi-kwantitatief geregistreerd.
Hier presenteren we een geoptimaliseerd NET-kleuringsprotocol dat geschikt is voor verschillende weefsels. We gebruikten een nieuw primair antilichaam om H3cit te kleuren en verminderden niet-specifieke kleuring met een autofluorescentieverlagend middel. Bovendien hebben we aangetoond dat NET-kleuring een constante hoge temperatuur en een zorgvuldige behandeling van monsters vereist.
Introduction
Neutrofiele extracellulaire vallen (NET’s) werden voor het eerst gevisualiseerd door Brinkmann et al. als een route van cellulaire dood die verschilt van apoptose en necrose in 20041. In deze route geven neutrofielen hun gedecondenseerde chromatine af in de extracellulaire ruimte om grote webachtige structuren te vormen die bedekt zijn met antimicrobiële eiwitten die voorheen in de korrels of cytosolen waren opgeslagen. Deze antimicrobiële eiwitten omvatten neutrofiele elastase (NE), myeloperoxidase (MPO) en gecitrullineerd histon H3 (H3cit), die vaak worden gebruikt voor indirecte immunofluorescentiedetectie van NET’s2. Deze methode identificeert niet alleen de kwantitatieve aanwezigheid van deze eiwitten; het heeft inderdaad het voordeel dat het specifiek NET-achtige structuren detecteert. In de NET’s co-lokaliseren de genoemde eiwitten samen met extracellulair DNA, wat kan worden gedetecteerd door een overlapping van de fluorescentiesignalen van elk gekleurd eiwit en het extracellulaire DNA. In tegenstelling tot de overlappende signalen als gevolg van extracellulaire co-lokalisatie van DNA en eiwitten in NET’s, vertonen intacte neutrofielen geen co-lokalisatie. Hier worden de NET-componenten meestal apart opgeslagen in de korrels, kernen en cytosol3.
Sinds hun eerste ontdekking is aangetoond dat NET een centrale rol spelen bij tal van ziekten, met name die waarbij ontstekingen betrokken zijn. NET’s vertonen antimicrobiële functies tijdens infectie door extracellulaire pathogenen in bloed en weefsel op te vangen en te doden 4,5. NET is echter ook in verband gebracht met auto-immuunziekten en hyperinflammatoire reacties, zoals systemische lupus erythematosus, reumatische artritis en allergisch astma 6,7,8. NET bevorderen vaso-occlusie en ontsteking bij atherosclerose, bloedplaatjeshechting en er wordt gespeculeerd dat ze een rol spelen bij uitgezaaide kanker 9,10,11. Desalniettemin wordt aangenomen dat ze ontstekingsremmende eigenschappen hebben door de pro-inflammatoire cytokineniveaus te verlagen12. Terwijl NET steeds meer belangstelling krijgt in een breder onderzoeksgebied, is een robuuste NET-detectiemethode van fundamenteel belang voor toekomstig onderzoek.
Hoewel de visualisatie van NET’s in verschillende weefsels met behulp van immunofluorescentiebeeldvorming complex is en maatwerk vereist, afgezien van elektronenmicroscopie, is het momenteel een van de meest gerenommeerde methoden voor het visualiseren van de interacties tussen NET’s en cellen en wordt het voornamelijk gebruikt in formaline-gefixeerde, in paraffine ingebedde weefsels (FFPE)13,14. Het vergelijken van NET-beeldvorming is echter moeilijk, omdat verschillende laboratoria hun eigen aangepaste protocollen gebruiken. Deze protocollen verschillen in het gebruik van antilichamen, antigeenextractie of permeabilisatiemethode en zijn vaak geoptimaliseerd voor een specifiek type weefsel 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ,27.
Nadat Brinkmann et al. de eerste methodische studie publiceerden met behulp van immunofluorescerende visualisatie van NET’s in FFPE-weefsel, wilden we dit protocol optimaliseren voor een grotere verscheidenheid aan weefsels en soorten15. Om een breed toepasbaar immunofluorescentieprotocol vast te stellen, hebben we bovendien verschillende aangepaste protocollen getest uit onderzoeken die immunofluorescentiemethoden in FFPE-weefsel gebruikten om NET’s te detecteren 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. Verder hebben we een nieuw H3cit-antilichaam geprobeerd voor meer specifieke extracellulaire kleuring28. Onze hypothese is dat door het systematisch aanpassen van de huidige kleuringsprotocollen aan verschillende soorten en weefsels, in vitro beeldvorming kan worden verbeterd, wat resulteert de een betere weergave van de interactie tussen neutrofielen en NET’s, zowel lokaal als systemisch.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit werk wilden we de bestaande protocollen voor het in beeld brengen van NET aanpassen en optimaliseren voor meer weefseltypes, te beginnen met het eigenlijke kleuringsproces. De eerste cruciale stap voor deze methode is de selectie van de meest geschikte antilichamen. Voor NE hebben we een NE-antilichaam van een muizengastheer op menselijk weefsel geprobeerd, dat geen betrouwbare kleuring vertoonde in vergelijking met NE van een konijnengastheer. Bovendien stelden Thålin et al. H3cit (R8) voor als een specifieker a…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek is opgezet door de Duitse Onderzoeksvereniging (BO5534). We danken Antonia Kiwitt, Moritz Lenz, Johanna Hagens, Dr. Annika Heuer en PD Dr. Ingo Königs voor het beschikbaar stellen van monsters. Daarnaast bedanken de auteurs het team van de UKE Microscopy Imaging Facility (Core facility, UKE Medical School) voor de ondersteuning bij de immunofluorescentiemicroscopie.
Materials
| Dilution | |||
| Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µg | abcam | Ab 68672 | 1:100 |
| Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody 100µg | abcam | Ab 5103 | 1:50 |
| Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µg | abcam | Ab 25989 | 1:50 |
| Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µg | abcam | Ab 90810 | 1:50 |
| Axiovision Microscopy Software | Zeiss | 4.8.2. | |
| Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml | GeneTex | GTX30972 | |
| Coverslips | Marienfeld | 0101202 | |
| Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10) | Dako | S2369 | |
| DAPI 25 mg | Roth | 6335.1 | 1:25000 |
| DCS antibody dilution 500 mL | DCS diagnostics | DCS AL120R500 | |
| Donkey ant goat Cy3 | JacksonImmunoResearch | 705-165-147 | 1:200 |
| Donkey anti rabbit AF647 | JacksonImmunoResearch | 711-605-152 | 1:200 |
| Donkey anti rabbit Cy3 | JacksonImmunoResearch | 711-165-152 | 1:200 |
| Fluoromount-G Mounting Medium | Invitrogen | 00-4958-02 | |
| Glass slide rack | Roth | H552.1 | |
| Human/Mouse MPO Antibody | R&D Systems | AF 3667 | 1:20 |
| Hydrophobic Pen | KISKER | MKP-1 | |
| Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg | abcam | Ab 37415 | 1:2000 and 1:250 |
| MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml | Maxvision | MB-L | |
| Microscopy camera | Zeiss | AxioCamHR3 | |
| Microwave | Bosch | HMT84M421 | |
| Mouse IgG1 negative control | Dako | X0931 Aglient | 1:50 and 1:5 |
| Normal Goat IgG Control | R&D Systems | AB-108-C | 1:100 |
| PBS Phosphate buffered saline (10x) | Sigma-Aldrich | P-3813 | |
| PMP staining jar | Roth | 2292.2 | |
| Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µg | abcam | Ab 219406 | 1:100 |
| Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] – Isotype Control 200µg | abcam | Ab 172730 | 1:300 |
| ROTI Histol | Roth | 6640 | |
| SuperFrost Plus slides | R. Langenbrinck | 03-0060 | |
| TBS Tris buffered saline (x10) | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Water bath | Memmert | 830476 | |
| Water bath rice cooker | reishunger | RCP-30 | |
| Wet chamber | Weckert Labortechnik | 600016 | |
| Zeiss Widefield microscope | Zeiss | Axiovert 200M |
Referências
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathogens. 5 (10), e1000639 (2009).
- Abu Abed, U., Brinkmann, V. Immunofluorescence labelling of human and murine neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded tissue. Journal of Visualized Experiments. (151), e60115 (2019).
- Kawasaki, H., Iwamuro, S. Potential roles of histones in host defense as antimicrobial agents. Infectious Disorders – Drug Targets. 8 (3), 195-205 (2008).
- Bianchi, M., Niemiec, M. J., Siler, U., Urban, C. F., Reichenbach, J. Restoration of anti-Aspergillus defense by neutrophil extracellular traps in human chronic granulomatous disease after gene therapy is calprotectin-dependent. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 127 (5), 1243-1252 (2011).
- Hakkim, A., et al. Impairment of neutrophil extracellular trap degradation is associated with lupus nephritis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (21), 9813-9818 (2010).
- Papadaki, G., et al. Neutrophil extracellular traps exacerbate Th1-mediated autoimmune responses in rheumatoid arthritis by promoting DC maturation. European Journal of Immunology. 46 (11), 2542-2554 (2016).
- Toussaint, M., et al. Host DNA released by NETosis promotes rhinovirus-induced type-2 allergic asthma exacerbation. Nature Medicine. 23 (6), 681-691 (2017).
- Fuchs, T. A., et al. Extracellular DNA traps promote thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15880-15885 (2010).
- Park, J., et al. Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps. Science Translational Medicine. 8 (361), (2016).
- Warnatsch, A., Ioannou, M., Wang, Q., Papayannopoulos, V. Inflammation. Neutrophil extracellular traps license macrophages for cytokine production in atherosclerosis. Science. 349 (6245), 316-320 (2015).
- Schauer, C., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps limit inflammation by degrading cytokines and chemokines. Nature Medicine. 20 (5), 511-517 (2014).
- Radermecker, C., Hego, A., Delvenne, P., Marichal, T. Identification and quantitation of neutrophil extracellular traps in human tissue sections. BioProtocol. 11 (18), e4159 (2021).
- de Buhr, N., von Köckritz-Blickwede, M. How neutrophil extracellular traps become visible. Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).
- Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in paraffin-embedded tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).
- Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).
- Santos, A., et al. NETs detection and quantification in paraffin embedded samples using confocal microscopy. Micron. 114, 1-7 (2018).
- Savchenko, A. S., et al. Neutrophil extracellular traps form predominantly during the organizing stage of human venous thromboembolism development. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (6), 860-870 (2014).
- O’Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).
- Barliya, T., et al. Possible involvement of NETosis in inflammatory processes in the eye: Evidence from a small cohort of patients. Molecular Vision. 23, 922-932 (2017).
- Xu, D., et al. Overproduced bone marrow neutrophils in collagen-induced arthritis are primed for NETosis: An ignored pathological cell involving inflammatory arthritis. Cell Proliferation. 53 (7), e12824 (2020).
- Nonokawa, M., et al. Association of neutrophil extracellular traps with the development of idiopathic osteonecrosis of the femoral head. American Journal of Pathology. 190 (11), 2282-2289 (2020).
- Tucker, S. L., Sarr, D., Rada, B. Neutrophil extracellular traps are present in the airways of ENaC-overexpressing mice with cystic fibrosis-like lung disease. BMC Immunology. 22 (1), 7 (2021).
- Knackstedt, S. L., et al. Neutrophil extracellular traps drive inflammatory pathogenesis in malaria. Science Immunology. 4 (40), (2019).
- Nakazawa, D., et al. Histones and neutrophil extracellular traps enhance tubular necrosis and remote organ injury in ischemic AKI. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (6), 1753-1768 (2017).
- Duler, L., Nguyen, N., Ontiveros, E., Li, R. H. L. Identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (157), e60834 (2020).
- Stehr, A. M., et al. Neutrophil extracellular traps drive epithelial-mesenchymal transition of human colon cancer. Journal of Pathology. 256 (4), 455-467 (2022).
- Thålin, C., et al. Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).
- Yamashita, S. Heat-induced antigen retrieval: Mechanisms and application to histochemistry. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
- Smyth, L., et al. Neutrophil-vascular interactions drive myeloperoxidase accumulation in the brain in Alzheimer’s disease. Acta Neuropathologica Communications. 10 (1), 38 (2022).
- Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 2-22 (2017).
- Nazir, S., Charlesworth, R. P. G., Moens, P., Gerber, P. F. Evaluation of autofluorescence quenching techniques on formalin-fixed chicken tissues. Journal of Immunological Methods. 496, 113097 (2021).
- Schneider, C., et al. IVIG regulates the survival of human but not mouse neutrophils. Scientific Reports. 7 (1), 1296 (2017).
- Risso, A. Leukocyte antimicrobial peptides: Multifunctional effector molecules of innate immunity. Journal of Leukocyte Biology. 68 (6), 785-792 (2000).
