एराबिडोप्सिस थैलियाना में पराग जलयोजन प्रोफाइल को मापने के लिए एक बेहतर विधि यहां वर्णित है। नई विधि उच्च रिज़ॉल्यूशन प्रदान करती है, गैर-आक्रामक है, और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है। प्रोटोकॉल परागण के शुरुआती चरणों को विनियमित करने वाली प्रक्रियाओं के बेहतर विच्छेदन के लिए एक नए उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है।
फूलों के पौधों में यौन प्रजनन के लिए पराग कण और स्टिग्माटिक सतह के बीच प्रारंभिक बातचीत की आवश्यकता होती है, जहां बातचीत करने वाले भागीदारों के बीच एक आणविक संवाद स्थापित किया जाता है। प्रजातियों की एक श्रृंखला में अध्ययन से पता चला है कि आणविक चौकियों की एक श्रृंखला पराग-कलंक बातचीत को नियंत्रित करती है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि केवल संगत, आम तौर पर इंट्रास्पेसिफिक पराग निषेचन को प्रभावित करने में सफल हो। उन प्रजातियों में जिनके पास ‘सूखा कलंक’ होता है, जैसे कि मॉडल प्लांट एराबिडोप्सिस थैलियाना, पहला पोस्ट-परागण, प्रीजाइगोटिक संगतता चेकपॉइंट पराग जलयोजन की स्थापना है।
परागण के इस चरण को कसकर विनियमित किया जाता है, जिससे पराग कण से संकेत कलंक से पानी की रिहाई प्राप्त करते हैं, इस प्रकार पराग जलयोजन की अनुमति मिलती है। समय के साथ पराग जलयोजन को सटीक रूप से मापने और ट्रैक करने की क्षमता प्रजनन में इस महत्वपूर्ण कदम के विनियमन को समझने के लिए निर्देशित प्रयोगों के डिजाइन के लिए महत्वपूर्ण है। प्रकाशित प्रोटोकॉल अक्सर उन फूलों का उपयोग करते हैं जिन्हें मूल पौधे से उत्पादित किया गया है, तरल या ठोस मीडिया पर बनाए रखा गया है, और थोक परागण किया गया है।
यह पेपर विवो परागण बायोसेसे में एक गैर-आक्रामक का वर्णन करता है जो उच्च रिज़ॉल्यूशन पर अलग-अलग ए थैलियाना पराग कणों के मिनट-दर-मिनट हाइड्रेशन ट्रैकिंग की अनुमति देता है। परख अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, पराग जलयोजन प्रोफाइल के बहुत सूक्ष्म रूपों का पता लगाने में सक्षम है, और इस प्रकार उत्परिवर्ती के विश्लेषण के लिए उपयुक्त है जो परागण को विनियमित करने वाले मार्गों को प्रभावित करते हैं। यद्यपि प्रोटोकॉल थोक परागण के लिए वर्णित लोगों की तुलना में लंबा है, लेकिन इसकी सटीक और प्रजनन क्षमता प्रदान करता है, साथ ही विवो प्रकृति में , इसे परागण फेनोटाइप के विस्तृत विच्छेदन के लिए आदर्श बनाता है।
एंजियोस्पर्म में सफल यौन प्रजनन आमतौर पर व्यक्तियों (यानी परागण) के भीतर या उनके बीच एथर से कलंक तक इंट्रास्पेसिफिक पराग कणों के हस्तांतरण पर निर्भर करता है। एक ग्रहणशील फूल में पराग कणों का यह हस्तांतरण आमतौर पर परागणकों या अजैविक कारकों द्वारा मध्यस्थता की जाती है; इस प्रकार, यह अक्सर प्राकृतिक परिस्थितियों में विषम पराग के जमाव में भी परिणाम देता है। कुछ अपवादों के साथ, विषम पराग द्वारा परागण की प्रगति क्रमिक रूप से हानिकारक है, जो खोए हुए संभोग के अवसरों के माध्यम से प्रजनन फिटनेस को कम करती है, जिसके परिणामस्वरूप अधिकांश संकर संतान या तो उचित रूप से विकसित होने में विफल रहती है या बाँझ होतीहै। इस प्रकार, ‘असंगत’ हेटरोस्पेसिफिक पराग2 द्वारा परागण को अवरुद्ध करने के लिए तंत्र विकसित हुए हैं। इसलिए संगत पराग की तेजी से पहचान यकीनन कई फूलों के पौधों में यौन प्रजनन के शुरुआती चरणों में सबसे महत्वपूर्ण प्रक्रिया है।
ब्रासिकेसी परिवार में, जहां कलंक ‘शुष्क’ प्रकार के होते हैं, आणविक चौकियों की एक श्रृंखला परागण को विनियमित करने वाली प्रजनन प्रक्रिया में कई चरणों में कार्य करती है, जैसे कि केवल संगत पराग सफल होता है। पराग जलयोजन सबसे महत्वपूर्ण चौकियों में से एक है (चित्रा 1), क्योंकि पराग जो हाइड्रेट करने में विफल रहता है, वह पराग ट्यूब का उत्पादन करने के लिए प्रगति नहीं कर सकता है और बाद में मादा गैमेटोफाइट को शुक्राणु वितरित करता है। अक्सर, असंगत अनाज इस पहले परागण चेकपॉइंट को पार करने में विफल रहते हैं, और इस प्रकार स्टिग्माटिकपानी तक पहुंच प्राप्त नहीं करते हैं। ब्रासिकेसी परिवार के सदस्यों के बीच, पराग की पहचान तेजी से होती है, जिसमें पिस्टिल 4,5 से पराग कण लगाव के मिनटों के भीतर संगतता स्थापित की जाती है। हाल के वर्षों में, बहुत प्रगति हुई है, और अब हम आणविक तंत्र को समझना शुरू कर रहे हैं जो प्रमुख परागण चौकियों को नियंत्रित करते हैं।
चित्रा 1: संगत परागण के दौरान प्रमुख घटनाओं का अवलोकन। ये चरण, जैसे पराग जलयोजन और पराग ट्यूब अंकुरण, परागण ‘चेकपॉइंट’ भी हैं जिन्हें संगत परागण को प्रभावित करने के लिए सफलतापूर्वक नेविगेट किया जाना चाहिए। आरेख एक ‘सूखा’ प्रकार के कलंक का प्रतिनिधित्व करता है, जो ब्रासिकेसी परिवार 2,20 की प्रजातियों के लिए विशिष्ट है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
ब्रासिका आत्म-असंगति (एसआई) प्रणाली पर अग्रणी शोध, जहां ‘स्वयं’ पराग को मान्यता प्राप्त है और अस्वीकार कर दिया गया है, ने ब्रासिकेसी 6,7,8,9,10 में पराग-कलंक मान्यता के लिए प्रतिमान स्थापित किया। ब्रासिका और उसके रिश्तेदारों में एसआई को ‘मान्यता’ प्रोटीन द्वारा मध्यस्थ किया जाता है जो पराग की सतह पर और स्टिग्माटिक प्लाज्मा झिल्ली पर रहते हैं, जो बातचीत पर, पराग अस्वीकृति का कारण बनते हैं। एसआई पराग अस्वीकृति बेसल पराग-कलंक संगतता प्रणाली के विघटन से संचालित होती है, जो संगत पराग की धारणा से पूरी तरह से सक्रिय होने पर, कलंक द्वारा लक्षित स्राव की ओर ले जाती है, इस प्रकार पराग जलयोजन को बढ़ावा देती है (पराग संगतता तंत्र की समीक्षा के लिए,देखें 11,12)। एसआई के उदाहरण में, पराग-जनित लिगैंड एक छोटा सिस्टीन युक्त प्रोटीन है, एस-लोकस सिस्टीन समृद्ध (एससीआर / एसपी 11), और स्टिग्माटिक रिसेप्टर एस-लोकस रिसेप्टर काइनेज (एसआरके) है।
हाल ही में, एराबिडोप्सिस थैलियाना में, छोटे सिस्टीन-समृद्ध पराग-जनित प्रोटीन का एक और समूह, पराग कोट प्रोटीन वर्ग बीएस (पीसीपी-बीएस में), पराग जलयोजन13 के सक्रियण के माध्यम से पराग स्वीकृति के महत्वपूर्ण नियामक पाए गए हैं। एटीपीसीपी-बी के स्टिग्माटिक रिसेप्टर्स और डाउनस्ट्रीम नियामक मार्ग के पहलुओं को भी हाल ही में14,15 वर्णित किया गया है। दिलचस्प बात यह है कि पराग जलयोजन (पीसीपी-बीएससहित) के संभावित पराग-जनित और स्टिग्माटिक सिग्नलिंग मध्यस्थों को एन्कोडिंग करने वाले जीन के उत्परिवर्तन संबंधी अध्ययन उन पौधों को उत्पन्न करने में विफल रहे हैं जिनके पास पराग जलयोजन चेकपॉइंट के लिए एक पूर्ण ब्लॉक है। यह दृढ़ता से सुझाव देता है कि कई अन्य, अभी तक अनदेखे, कारक पराग जलयोजन के नियमन में भूमिका निभाते हैं। वांग एट अल.13 द्वारा पहली बार वर्णित विधि के आधार पर, यहां हम उम्मीदवार उत्परिवर्ती ए थैलियाना लाइनों में सूक्ष्म पराग जलयोजन दोषों की पहचान के लिए उपयुक्त विवो बायोसेसे में एक बेहतर उच्च-रिज़ॉल्यूशन का वर्णन करते हैं।
फूलों के पौधों के लिए, यौन प्रजनन के बहुत शुरुआती चरण यकीनन सबसे महत्वपूर्ण हैं। पराग-कलंक बातचीत के स्तर पर, आणविक निर्णय किए जाते हैं जो बातचीत करने वाले भागीदारों की ‘संगतता’ निर्धारित करते हैं। इस तरह के निर्णय, यदि सही ढंग से किए जाते हैं, तो संसाधनों की बर्बादी से बचें जो प्रजनन फिटनेसको प्रभावित कर सकते हैं। इस प्रकार, निषेचन को प्रभावित करने के लिए केवल संगत पराग की अनुमति देना अच्छी तरह से अनुकूलित जीनोटाइप को बनाए रखने का एक महत्वपूर्ण घटक है, और इस प्रकार प्रजातियों की विकासवादी सफलता। मॉडल प्लांट ए थलियाना के साथ किए गए शोध इस प्रक्रिया की हमारी समझ को गहरा करने में बेहद मूल्यवान रहे हैं। पिछले कुछ दशकों में कई अध्ययनों ने पराग कोट में कारकों की उपस्थिति का खुलासा किया है जो पहले संगतता ‘चेकपॉइंट’ पर कार्य करते हैं, जहां पराग पराग जलयोजन की अनुमति देने के लिए स्टिग्माटिक पानी तक पहुंच प्राप्तकरता है। पराग-कलंक संगतता को विनियमित करने वाले तंत्र में इन पहली अंतर्दृष्टि के बावजूद, इस प्रक्रिया की हमारी समझ में अभी भी कई अंतराल हैं। आज तक, पराग-जनित लिगेंड या स्टिग्माटिक रिसेप्टर्स का कोई भी उत्परिवर्ती जो पराग जलयोजन को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है, संगत परागण को पूरी तरह से अवरुद्ध नहीं कर सकता है, जो अन्य अज्ञात पराग जलयोजन निर्धारकों की उपस्थिति का सुझाव देता है। रुचि के फेनोटाइप का आसानी से निरीक्षण करने में सक्षम होने से, यहां वर्णित पराग हाइड्रेशन बायोसेसे परागण को नियंत्रित करने वाले संभावित उत्परिवर्ती का अध्ययन करने के लिए सबसे सरल तकनीकों में से एक है।
पराग जलयोजन को मापने के लिए मौजूदा पद्धतियां आमतौर पर थोक परागण का उपयोग करती हैं और कम समय बिंदु14,22,23 की रिपोर्ट करती हैं, और इस प्रकार महत्वपूर्ण सूक्ष्म हाइड्रेशन प्रोफाइल फेनोटाइप ्स को याद कर सकती हैं। उदाहरण के लिए, वांग एट अल.13 द्वारा किए गए अध्ययन, हमारी प्रयोगशाला में अन्य पराग कोट प्रोटीन उत्परिवर्ती (अप्रकाशित अवलोकन) पर काम के साथ, उत्परिवर्ती के बीच हाइड्रेशन प्रोफाइल में पेचीदा अंतर का पता चला है। इस तरह के सूक्ष्म अंतर संगत परागण अंतर्निहित नियामक तंत्र के लिए महत्वपूर्ण सुराग रख सकते हैं।
यहां वर्णित विधि उत्परिवर्ती और डब्ल्यूटी पौधों की लाइनों के बीच अपेक्षाकृत कम संख्या में माप के अधिग्रहण पर केंद्रित है, जिसमें डेटासेट के भीतर भिन्नता को कम करने के लिए पद्धतिगत परिशुद्धता पर जोर दिया गया है। जबकि यह विधि अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है (जैसा कि चित्र 7 में दिखाया गया है), यह मानते हुए कि तापमान और आर्द्रता पर्याप्त रूप से नियंत्रित हैं, भिन्नता की संभावना को कम करने के लिए उसी दिन लगभग समान संख्या में डब्ल्यूटी और उत्परिवर्ती पराग के लिए हाइड्रेशन डेटा इकट्ठा करना महत्वपूर्ण है। यदि आवश्यक हो तो डेटा को अलग-अलग दिनों में पूल किया जा सकता है। इसके अलावा, हाइड्रेशन परिणामों की सही व्याख्या के लिए उपयुक्त डब्ल्यूटी नियंत्रण पौधों का चयन करना महत्वपूर्ण है। पराग प्राप्तकर्ता के लिए, डब्ल्यूटी नियंत्रण और उत्परिवर्ती पराग कण दोनों प्राप्त करने के लिए एक ही पौधे की लाइन का उपयोग किया जाना चाहिए।
उदाहरण के लिए, हम टी-डीएनए पराग उत्परिवर्ती लाइनों (जैसे चित्रा 8 में वर्णित ‘केडी’ उत्परिवर्ती) की जांच करते समय डब्ल्यूटी (नियंत्रण) और उत्परिवर्ती (प्रयोगात्मक) पराग दोनों के लिए पराग प्राप्तकर्ता के रूप में पीए 9-बार्नेस नर बाँझ पौधे लाइन का उपयोग करते हैं, जिसे वीडियो प्रोटोकॉल में भी चित्रित किया गया है। इस तरह के पुरुष बाँझ रेखा से डेटा का मिश्रण, जिसे अनुकरण करने की आवश्यकता नहीं है, को मैन्युअल रूप से एमास्कुलेटेड कंट्रोल लाइन से एकत्र करने से बचा जाना चाहिए क्योंकि ये कलंक संभवतः अलग तरह से व्यवहार करेंगे। इसी तरह, जब भी संभव हो, एमस्क्युलेटेड म्यूटेंट लाइनों का उपयोग एक एमस्क्युलेटेड डब्ल्यूटी (नियंत्रण) लाइन के साथ संयोजन के रूप में किया जाना चाहिए। अध्ययन के तहत पौधों की आनुवंशिक पृष्ठभूमि पर विचार करते समय भी यही सावधानी बरतनी चाहिए। जबकि सबसे लोकप्रिय टी-डीएनए उत्परिवर्ती संग्रह कोल -0 पृष्ठभूमि में उत्पन्न हुए थे, अन्य, जैसे कि इंस्टीट्यूट नेशनल डे ला रेचरचे एग्रोनोमिक (आईएनआरए) से फ्लैग संग्रह, वासिलेवस्कीजा (डब्ल्यूएस) आनुवंशिक पृष्ठभूमि24,25 में उपलब्ध हैं। ऐसे मामलों में, नियंत्रण के रूप में संबंधित इकोटाइप की डब्ल्यूटी प्लांट लाइनों का उपयोग करना उचित है।
यद्यपि यहां हमने पराग-कलंक बातचीत के पहले 10 मिनट में पराग जलयोजन पर ध्यान केंद्रित किया है, इस विधि को हाइड्रेशन प्रोफाइल को शामिल करने के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है जो लंबे समय तक कवर करते हैं। प्रोटोकॉल की एक प्रमुख विशेषता यह है कि फूल मूल पौधे से जुड़े रहते हैं-वर्तमान प्रकाशित प्रोटोकॉल को आमतौर पर प्रयोग की अवधि 14,18,26 के लिए ऊतक को बनाए रखने के लिए पिस्टिल के छांटने और मीडिया में प्लेसमेंट की आवश्यकता होती है। यद्यपि यह सुझाव देने के लिए कोई प्रत्यक्ष प्रमाण नहीं है कि इस तरह के एक अर्ध विवो दृष्टिकोण पराग जलयोजन को प्रभावित करता है या वास्तव में इस प्रक्रिया के विवो विनियमन को बदल देता है, यह कल्पनीय है कि मूल पौधे से फूलों का छांटना परागण को प्रभावित कर सकता है। इस प्रकार, यह प्रोटोकॉल पराग-कलंक बातचीत के अध्ययन के लिए विवो वातावरण में एक सच प्राप्त करता है, जहां पौधे की संरचनात्मक अखंडता संरक्षित है।
एकल पराग कणों का ‘वर्जिन’ स्टिग्माटिक पैपिल्ले में स्थानांतरण यकीनन इस प्रोटोकॉल में वर्णित सबसे चुनौतीपूर्ण कार्यों में से एक है। त्रुटि में पराग कणों के समूहों को स्थानांतरित करना असामान्य नहीं है। हालांकि, ऐसा होने की संभावना को यह सुनिश्चित करके बहुत कम किया जा सकता है कि पराग का केवल एक मोनोलेयर बल (चित्रा 3 ए) (या यहां तक कि सिर्फ एक पराग कण) पर मौजूद है; चित्रा 5), और / या पराग कणों का उपयोग करके जो पहले से ही केंद्रित हैं, जैसे कि वे बल की नोक पर दूसरों से ‘बाहर निकले’ हैं। हमने पाया है कि एक अनुभवी ऑपरेटर लगभग 3 मिनट में एक एकल पराग के हस्तांतरण को सफलतापूर्वक पूरा कर सकता है और 1 घंटे की अवधि में पांच पराग कणों तक डेटा रिकॉर्ड कर सकता है। इस प्रकार, 2-4 दिनों की अवधि में, अध्ययन के तहत संयंत्र लाइनों के सार्थक सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए पर्याप्त डेटा जमा किया जा सकता है।
मानव त्रुटि संभावित रूप से इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने वाले अध्ययनों से प्राप्त डेटासेट के विश्लेषण में भिन्नता का सबसे बड़ा स्रोत है। उदाहरण के लिए, छवि विश्लेषण के दौरान ‘पराग सीमा’ की परिभाषा व्यक्तिगत शोधकर्ता के निर्णय पर आती है। इस प्रकार, यह संभावना है कि विभिन्न शोधकर्ताओं द्वारा किए गए माप, यहां तक कि एक ही डेटासेट पर भी, भिन्नता उत्पन्न कर सकते हैं। जहां भी संभव हो, एक एकल शोधकर्ता को नमूना त्रुटियों को कम करने के लिए माप करना चाहिए। इसके अलावा, एक ही ऑपरेटर द्वारा डब्ल्यूटी और उत्परिवर्ती डेटासेट के विश्लेषण को युग्मित करना ‘पराग सीमा’ और इंटरऑपरेटर भिन्नता की संभावित व्यक्तिपरक परिभाषा को नकारता है।
अंत में, मॉडल जीव ए थैलियाना में पराग जलयोजन प्रोफाइल को मापने के लिए एक परिष्कृत लेकिन सटीक विधि का वर्णन किया गया है। हमने दिखाया है कि, इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, ए थैलियाना के लिए अत्यधिक सुसंगत पराग जलयोजन डेटा आसानी से प्राप्त किया जा सकता है। अलग-अलग दिनों में प्राप्त डब्ल्यूटी परागण के लिए डेटा के तीन स्वतंत्र बैचों ने सभी समय बिंदुओं पर <3% के लगातार छोटे विचलन दिखाए (चित्रा 7 और पूरक तालिका एस 1)। यद्यपि यहां प्रस्तुत बायोसेसे अधिकांश मौजूदा प्रोटोकॉल की तुलना में थोड़ा अधिक जटिल है, उत्पन्न डेटा का रिज़ॉल्यूशन बेहतर है और नए उत्परिवर्ती की पहचान और लक्षण वर्णन के लिए उपयुक्त है जो संगत परागण को विनियमित करने वाले मार्गों को प्रभावित करते हैं।
The authors have nothing to disclose.
इस शोध को बाथ विश्वविद्यालय (बाथ विश्वविद्यालय, बाथ, यूके, बीए 2 7एवाई) स्नातकोत्तर छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित किया गया था। और एलडब्ल्यू चित्रा 1 BioRender.com (https://biorender.com/) के साथ बनाया गया था।
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Nikon Digit sight DS-U1 | Nikon | DS-U1 | Microscope camera (coupletd to SMZ1500) |
Nikon Eclipse TE2000-S Inverted Microscope | Nikon | TE2000-S | Inverted microscope |
Nikon SMZ1500 Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | Stereomicroscope |
Nikon DS-Fi3 microscope camera | Nikon | DS-Fi3 | Microscope camera (coupletd to TE2000-S) |
Nikon NIS-Elements Basic Research | Nikon | NIS-Elements BR | Image accquisition and analysis software (for DS-Fi3) |
Nikon NIS-Elements F | Nikon | NIS-Elements F | Image accquisition and analysis software (for DS-U1) |
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