Биоанализ гидратации пыльцы in vivo с высоким разрешением для гидратации пыльцы Arabidopsis thaliana

Summary

Улучшенный метод измерения профилей гидратации пыльцы у Arabidopsis thaliana описан здесь. Новый метод предлагает более высокое разрешение, является неинвазивным и легко воспроизводимым. Протокол представляет собой новый инструмент для более тонкого вскрытия процессов, регулирующих ранние стадии опыления.

Abstract

Половое размножение у цветковых растений требует начального взаимодействия между пыльцевым зерном и стигматической поверхностью, где между взаимодействующими партнерами устанавливается молекулярный диалог. Исследования на различных видах показали, что ряд молекулярных контрольных точек регулируют взаимодействие пыльцы и стигмы, чтобы гарантировать, что только совместимая, как правило, внутривидовая пыльца успешно осуществляет оплодотворение. У видов, обладающих «сухим рыльцем», таких как модельное растение Arabidopsis thaliana, первой контрольной точкой после опыления презиготической совместимости является установление гидратации пыльцы.

Эта фаза опыления жестко регулируется, в результате чего сигналы от пыльцевого зерна вызывают высвобождение воды из рыльца, тем самым обеспечивая гидратацию пыльцы. Способность точно измерять и отслеживать гидратацию пыльцы с течением времени является ключом к разработке экспериментов, направленных на понимание регуляции этого важного этапа размножения. В опубликованных протоколах часто используются цветы, которые были вырезаны из материнского растения, содержались на жидких или твердых средах и опылялись в больших количествах.

В этой статье описывается неинвазивный биоанализ опыления in vivo , который позволяет поминутно отслеживать гидратацию отдельных пыльцевых зерен A. thaliana с высоким разрешением. Анализ обладает высокой воспроизводимостью, способен обнаруживать очень тонкие вариации профилей гидратации пыльцы и, таким образом, подходит для анализа мутантов, влияющих на пути, регулирующие опыление. Хотя протокол длиннее, чем те, которые описаны для объемного опыления, точность и воспроизводимость, которые он обеспечивает, наряду с его природой in vivo , делают его идеальным для детального вскрытия фенотипов опыления.

Introduction

Успешное половое размножение у покрытосеменных обычно зависит от переноса внутривидовых пыльцевых зерен от пыльника к рыльцу, либо внутри, либо между особями (т.е. опыление). Этот перенос пыльцевых зерен на восприимчивый цветок обычно опосредован опылителями или абиотическими факторами; Таким образом, это также часто приводит к отложению гетероспецифической пыльцы в естественных условиях. За некоторыми исключениями, прогрессирование опыления гетероспецифической пыльцой является эволюционно невыгодным, снижая репродуктивную пригодность из-за утраченных возможностей спаривания, при этом большинство полученного гибридного потомства либо не развиваются должным образом, либо являются стерильными¹. Таким образом, развились механизмы, блокирующие опыление «несовместимой» гетероспецифической пыльцой². Таким образом, быстрое распознавание совместимой пыльцы является, пожалуй, наиболее важным процессом на ранних стадиях полового размножения у многих цветковых растений.

В семействе Brassicaceae, где рыльца относятся к «сухому» типу, ряд молекулярных контрольных точек действует на нескольких стадиях репродуктивного процесса, регулируя опыление, так что только совместимая пыльца является успешной. Гидратация пыльцы является одной из наиболее важных контрольных точек (рис. 1), поскольку пыльца, которая не гидратируется, не может прогрессировать, образуя пыльцевую трубку и впоследствии доставляя сперму женскому гаметофите. Часто несовместимые зерна не проходят этот первый контрольный пункт опыления и, таким образом, не получают доступа к стигматической воде³. Среди представителей семейства Brassicaceae распознавание пыльцы происходит быстро, при этом совместимость устанавливается в течение нескольких минут после прикрепления пыльцевого зерна к пестику ^4,5. В последние годы был достигнут большой прогресс, и теперь мы начинаем понимать молекулярные механизмы, которые регулируют ключевые контрольные точки опыления.

Рисунок 1: Обзор ключевых событий во время совместимого опыления. Эти стадии, такие как гидратация пыльцы и прорастание пыльцевых трубок, также являются «контрольными точками» опыления, которые необходимо успешно преодолеть, чтобы обеспечить совместимое опыление. На диаграмме представлено рыльце «сухого» типа, характерное для видов семейства Brassicaceae ^2,20. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Новаторские исследования системы самонесовместимости (SI) Brassica, в которой «самостоятельная» пыльца распознается и отклоняется, установили парадигму распознавания пыльцы-стигмы у Brassicaceae 6,7,8,9,10. СИ у Brassica и его родственников опосредован белками «распознавания», которые находятся на поверхности пыльцы и на стигматической плазматической мембране, которые при взаимодействии приводят к отторжению пыльцы. Отторжение пыльцы СИ происходит за счет нарушения системы совместимости базальной пыльцы и стигмы, которая при полной активации восприятием совместимой пыльцы приводит к целенаправленной секреции стигмой, тем самым стимулируя гидратацию пыльцы (обзоры механизма совместимости пыльцы см.^11,12). В примере SI переносимый пыльцой лиганд представляет собой небольшой богатый цистеином белок, богатый S-локусом цистеином (SCR/SP11), а стигматический рецептор представляет собой киназу S-локуса рецептора (SRK).

Недавно было обнаружено, что у Arabidopsis thaliana другая группа небольших белков, богатых цистеином, переносимых пыльцой, белков пыльцевой оболочки класса B (AtPCP-Bs), является важным регулятором принятия пыльцы посредством активации гидратации пыльцы¹³. Также недавно были описаны стигматические рецепторы AtPCP-B и аспекты нисходящего регуляторного пути^14,15. Интересно, что мутационные исследования генов, кодирующих потенциальные пыльцевые и стигматические сигнальные медиаторы гидратации пыльцы (включая AtPCP-Bs), не смогли создать растения, которые полностью блокируют контрольную точку гидратации пыльцы. Это убедительно свидетельствует о том, что множество других, еще не открытых, факторов играют роль в регуляции гидратации пыльцы. Основываясь на методе, впервые описанном Wang et ^al.13, здесь мы описываем улучшенный биоанализ in vivo с высоким разрешением, подходящий для идентификации тонких дефектов гидратации пыльцы в линиях мутантов-кандидатов A. thaliana.

Protocol

1. Выращивание растений и подготовка цветов Семена A. thaliana стратифицировать в 0,1% агарозе или стерильной воде в течение 3 дней при 4 °C или в виде сухих семян в течение 16-24 ч при -20 °C (uNASC, личное сообщение). Переложите стратифицированные семена в горшки с компостом и поместите в камеру для выращивания с контролируемой средой. Размножайте растения фотопериодом 16:8 ч, светлый: темный, обеспечиваемый люминесцентными лампами (130 мкмоль м-2 с-1). Поддерживайте температуру 21 ± 2 °C при относительной влажности воздуха около 40%. Убедитесь, что растения-доноры и реципиенты пыльцы, а также любые другие соответствующие «контрольные» линии растений посеяны вместе, чтобы обеспечить синхронное цветение. Размножайте растения примерно 6 недель, пока соцветия хорошо не укоренятся. Выберите цветочные почки стадии 12 на растении-реципиенте пыльцы за 1 день до проведения биотеста на выхолащивание 16,17 – это нераскрывшиеся цветочные почки, которые завершат раскрытие цветка и расхождение пыльника на следующий день18.ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте первых трех цветков, образующихся на главном соцветии, так как они обычно проявляют необычное репродуктивное поведение. Если это возможно и подходит для исследования, используйте мужскую стерильную линию растений, такую как линия pA9-барназы A. thaliana (присоединение Col-0), где пыльники не созревают19. Чтобы выхолостить цветы реципиента пыльцы, поместите растение в горшок на бок. Приклейте стебель растения в области, близкой к цветкам, которые будут выхолощены, к предметному стеклу, который находится под стереомикроскопом. С помощью щипцов с тонкими наконечниками осторожно раздразните цветочный бутон и удалите все лепестки и пыльники цветка. Убедитесь, что пестик не поврежден и рыльце не загрязняет пыльцу.ПРИМЕЧАНИЕ: Мужские стерильные линии растений не требуют выхолащивания. Верните растения в камеру роста и убедитесь, что выхолощенные цветы не соприкасаются с другими растениями или посторонними предметами. 2. Анализ гидратации пыльцы – сбор исходных данных На следующее утро извлеките растения из камеры роста. Положите растение-реципиент пыльцы на бок и поместите цветок на столик перевернутого микроскопа (рис. 2) так, чтобы рыльце можно было четко изобразить. Зафиксируйте положение цветка, который будет изображен, иммобилизовав стебель к предметному стеклу с помощью полосок малярного скотча. Поддерживайте температуру от 18 °C до 25 °C и относительную влажность воздуха ниже 60%.ПРИМЕЧАНИЕ: Для мужской стерильной линии растений pA9-барназы оптимально проводить анализ утром, когда цветки раскрываются и лепестки не мешают полю зрения. Далее удаляют здоровый и только что раскрывшийся цветок с растения-донора пыльцы. Поместите под препарирующий микроскоп и соберите несколько пыльцевых зерен на кончике чистых щипцов с тонкими наконечниками, осторожно прикоснувшись к пыльникам (рис. 3A). Ресница, приклеенная к короткому стержню, также является эффективным инструментом для сбора и переноса пыльцы (рис. 3В). Удалите излишки пыльцы с щипцов, слегка прикоснувшись ими к лепесткам цветов, откуда были собраны пыльцевые зерна, до тех пор, пока на кончике щипцов не образуется монослой пыльцевых зерен.ПРИМЕЧАНИЕ: Монослой пыльцевых зерен на кончике щипцов с тонкими наконечниками значительно облегчит перенос одного зерна на последующих этапах. С помощью этой техники также можно получить одно единственное пыльцевое зерно на щипцах (дополнительное видео S1). Вернитесь к растению-реципиенту пыльцы и, используя маломощную линзу объектива (например, 10-кратную линзу объектива; Рисунок 3Б), сфокусируйте перевернутый микроскоп на рыльце, подлежащем опылению. Держа щипцы вдоль отверстия между плечами щипцов (рис. 4), осторожно подойдите к неопыленной («девственной») клеточке рыльца сосочка.ПРИМЕЧАНИЕ: Мы обнаружили, что этот метод удержания щипцов помогает ловкости и уменьшает влияние трясущихся рук. Микроманипулятор может быть использован для пользователей, которые менее опытны или испытывают трудности с точным нанесением одного пыльцевого зерна вручную. Выберите правильно расположенное пыльцевое зерно на щипцах для переноса на рыльце. Продолжайте приближаться к неопыленной ячейке рыльца сосочка до тех пор, пока выбранное пыльцевое зерно не соприкоснется с его поверхностью. Медленно извлеките щипцы и подтвердите прикрепление пыльцы (рисунок 5).ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительное видео S1 и Дополнительное видео S2 демонстрируют этот шаг как с одиночными, так и с несколькими пыльцевыми зернами, присутствующими на щипцах. Убедитесь, что пыльцевое зерно ориентировано таким образом, чтобы его экваториальная ось была хорошо видна и находилась в четком фокусе. Немедленно переключитесь на объектив большей мощности (например, 20-кратный) и сделайте снимок пыльцевого зерна. Это первое изображение T = 0. Продолжайте делать дальнейшие снимки с интервалом в 1 минуту, в общей сложности 10 минут. Отрегулируйте фокус по мере необходимости, чтобы приспособиться к небольшим движениям пыльцевого зерна или рыльца. Записывайте температуру окружающей среды и относительную влажность в помещении каждые 2 минуты, чтобы в будущем можно было сравнивать экспериментальные копии. После того, как все изображения будут захвачены, сохраните их в формате без потерь, например в проприетарном формате производителя или в формате TIFF.ПРИМЕЧАНИЕ: На каждое взятое пыльцевое зерно будет отобрано 11 изображений (дополнительный рисунок S1). Автоматические/ручные настройки покадровой съемки в большинстве проприетарных программ для получения изображений являются полезными функциями для облегчения организации каждого временного ряда. Повторите шаги с 2.4 по 2.9 для получения дополнительных пыльцевых зерен. Сбор данных о почти эквивалентном количестве контрольных (дикий тип [WT]) и экспериментальных опылений. Рисунок 2: Настройка оборудования, используемого для биоанализа гидратации пыльцы. В этом примере реципиентом пыльцы была линия стерильных растений мужского пола pA9-барназы. Растение в горшке было помещено на бок, а стебель приклеен к предметному стеклу, расположенному на предметном столике микроскопа. Чтобы уменьшить механическое напряжение и облегчить позиционирование растения, была использована регулируемая платформа для поддержки горшка с растением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 3: Сбор пыльцевых зерен из цветка-донора пыльцы. На изображениях показано использование (А) щипцов с тонкими наконечниками и (В) кусочка ресницы. Сгустки пыльцы (красная стрелка) следует удалять, слегка прикасаясь ими к лепесткам цветков-доноров до получения монослоя пыльцевых зерен (зеленая стрелка). (B) Изображение с высоким разрешением неопыленного пятна стерильной линии A. thaliana (Col-0) pA9-барназы, достигшего соответствующей стадии развития для биоанализа гидратации пыльцы. Масштабная линейка = 100 мкм (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 4: Способ удержания щипцов при переносе пыльцы на рыльце реципиента. А) неправильная ориентация для удержания щипцов; (Б) правильная ориентация для удержания щипцов. Удержание щипцов боком в этой конфигурации, о чем свидетельствует положение большого пальца между плечами щипцов, обеспечивает большую стабильность, облегчая перенос пыльцевых зерен на неопыленные стигматические сосочки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 5: Перенос одного пыльцевого зерна с кончика пары щипцов на неопыленную («девственную») клетку рыльца сосочка стерильного растения мужского пола pA9-барназы. (А) Осторожно подходите к клетке сосочка. (B) Прикрепление правильно расположенного пыльцевого зерна (синяя стрелка) к ячейке сосочка (оранжевая стрелка). (C) Снятие щипцов и визуальное подтверждение прикрепления пыльцы (фиолетовая стрелка). Панели A-C были изображены с помощью 10-кратного объектива (рабочее расстояние 10,5 мм; числовая апертура 0,25) и представляют собой снимки, полученные из видеоклипа, представленного в дополнительном видео S1. (D) Переход на 20-кратный объектив (рабочее расстояние 2,1 мм; числовая апертура 0,5) для начала захвата изображения во временном ряду. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. 3. Анализ гидратации пыльцы Определите скорость гидратации пыльцы как изменение длины малой полуоси (рис. 6) пыльцевого зерна (т. е. экваториального радиуса) с течением времени и представьте ее в виде процентного изменения (уравнение [1]): (1) Используя программное обеспечение для анализа изображений, запишите значения полумалых осей для каждого пыльцевого зерна в экспериментальной серии.ПРИМЕЧАНИЕ: Название этого параметра измерения зависит от программного обеспечения, например, «Повернутый эллипс» или «5-точечный эллипс». Повторите шаги 3.1-3.2 для всех других пыльцевых зерен, подлежащих измерению. Для согласованности примените одинаковую степень цифрового масштабирования и один и тот же подход к определению «границы пыльцы» для всех измерений в наборах данных. После того, как все измерения будут завершены для временного ряда, экспортируйте необработанные значения полувторостепенных осей каждого стека изображений в электронную таблицу и представьте данные в столбцах для каждого стека изображений. Обеспечьте включение в анализ данных не менее 15 гидратированных пыльцевых зерен для каждой линии растений (дополнительная таблица S1). Нет ничего необычного в том, что небольшое количество пыльцевых зерен не гидратируется или гидратируется значительно медленнее, чем ожидалось. Эти «неуклюжие» зерна могут быть результатом плохого контакта между зерном и клеткой сосочка или связаны с жизнеспособностью пыльцы. Ищите и исключайте их из набора данных, если они не требуются в их экспериментальном дизайне. Рассчитайте средние значения для каждого момента времени для каждой линии растения. Используйте непарные t-критерии и односторонний ANOVA для статистического анализа данных гидратации от WT и мутантных линий в каждый момент времени. Используйте множественный t-критерий для одновременного сравнения средних значений между WT и мутантными линиями в несколько временных точек.ПРИМЕЧАНИЕ: Графики XY также очень полезны для визуализации общей тенденции увлажнения пыльцы между сравниваемыми линиями растений. Рисунок 6: Гидратация пыльцевого зерна WT на клетке сосочка A. thaliana (Col-0; pA9-барназная мужская стерильная линия). (A) Нулевая точка времени, 0 (0 MAP) и (B) 10 MAP. Красный круг вокруг пыльцевого зерна — это «граница пыльцы», определенная и нарисованная оператором с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Зеленые и темно-красные линии внутри пыльцы представляют собой большую и полумалую оси соответственно. Длина полумалой оси используется для расчета степени гидратации пыльцы. Полный временной ряд этого набора данных можно найти на дополнительном рисунке S1. Изображение было получено с помощью 20-кратного объектива (рабочее расстояние 2,1 мм; числовая апертура 0,5). Масштабные линейки = 50 мкм. Аббревиатура: MAP = мин-после-опыления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Representative Results

В этом разделе представлены два набора примеров данных о гидратации пыльцы, собранных, как описано выше, для A. thaliana. Первый набор данных состоит из трех реплик временного ряда гидратации пыльцы для растений WT, причем каждая реплика собирается в другой день. Каждая реплика содержит не менее 18 отдельных значений пыльцевых зерен, в общей сложности 55 пыльцевых зерен во всех трех репликах. Минимальные и максимальные значения средних значений между репликами для всех моментов времени находились в пределах 3% (рис. 7 и дополнительная таблица S1). Эти репрезентативные данные для опыления WT ясно демонстрируют высокую степень согласованности, которая может быть получена с использованием методологии, подробно описанной здесь, для относительно небольшого количества выборок и в разные дни. Рисунок 7: График XY, показывающий консистенцию профилей гидратации пыльцы дикого типа A. thaliana в течение 10-минутного периода времени. Родителем пыльцы было присоединение Col-0 A. thaliana, а родителем пестика была стерильная линия pA9-барназы мужского пола A. thaliana (Col-0). Данные представляют собой три независимых набора данных, собранных в разные дни, и демонстрируют высокую степень согласованности. Диаграмма прямоугольника и усов и статистический анализ средних значений для этих наборов данных представлены на дополнительном рисунке S2. Количество измеренной пыльцы (‘n’) для каждого независимого набора данных отображается рядом с синтаксисом (WT1/WT2/WT3) на рисунке. Аббревиатура: WT = дикий тип. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Второй набор данных был получен для линии растений, содержащей вставку Т-ДНК в ген, кодирующий белок пыльцевой оболочки, генерирующий «нокдаунную» мутацию, здесь называемую «мутантом KD». Мутантную пыльцу осаждали на стерильные рыльца самцов pA9-барназы для гидратационного профилирования, как описано в протоколе. Как видно из полученных данных (рис. 8), мутантная пыльца и пыльца WT имели неразличимые профили гидратации в течение первых 5 минут. Однако через 5-10 минут после опыления (MAP) среднее полунезначительное изменение оси для мутантной пыльцы начало отставать от такового у пыльцы WT, причем разница стала статистически значимой при 10 MAP. Этот результат не только демонстрирует, что этот белок пыльцевой оболочки играет роль в опосредовании гидратации пыльцы, но также прекрасно иллюстрирует полезность этого однозернового биотеста с высоким разрешением для отслеживания гидратации пыльцы. В этом конкретном примере его чувствительность смогла обнаружить тонкий эффект «нокдауна» гена, кодирующего белок пыльцевой оболочки. Рисунок 8: Профили гидратации пыльцы для WT и мутантной линии белка пыльцевой оболочки «нокдауна» (мутант KD). (A) Профили гидратации в течение 10-минутного периода времени для WT и мутантной пыльцы. Родителями пыльцы были присоединение Col-0 A. thaliana и мутант белка пыльцевой оболочки KD (также на фоне Col-0). В обоих случаях родителем пестика была стерильная линия pA9-барназы A. thaliana (Col-0). (B) Прямоугольные и усовые графики, показывающие степень гидратации пыльцы (с точки зрения процентного изменения полумалой оси) при 5 MAP и 10 MAP для наборов данных WT и мутантной пыльцы. Усы представляют собой минимальные и максимальные значения выборки. В прямоугольниках показаны нижний квартиль, медиана и верхний квартиль набора данных. Белые крестики представляют собой среднее значение набора данных. Анализ непарного t-критерия показывает, что средний процент гидратации пыльцы значительно различается между двумя линиями растений при 10 MAP. Одна звездочка указывает на p < 0,05 (непарный t-критерий). Сокращения: WT = дикий тип; КД = нокдаун; MAP = мин. после опыления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Дополнительный рисунок S1: Временной ряд биоанализа для гидратации обрезанной пыльцы при гидратации пыльцевого зерна WT на стигматической клетке сосочка стерильного растения мужского пола pA9-барназы в течение 10 минут. Снимки были сделаны с интервалом в 1 минуту. Изображения на 0 MAP и 10 MAP были использованы на рисунке 6 (прилагаются отдельно). Масштабная линейка = 50 мкм. Сокращения: WT = дикий тип; MAP = мин. после опыления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный рисунок S2: График прямоугольника и уса, показывающий степень гидратации пыльцы (с точки зрения процентного изменения полумалой оси) в течение 10-минутного периода времени для трех наборов данных пыльцы WT, описанных на рисунке 7. Родителем пестика была стерильная линия pA9-барназы A . thaliana (Col-0). Усы представляют собой минимальные и максимальные значения выборки. В прямоугольниках показан нижний квартиль (нижний шарнир), медиана (средний шарнир) и верхний квартиль (верхний шарнир) набора данных. Отображаются отдельные точки данных. Односторонний ANOVA показывает, что средний процент значений гидратации пыльцы между тремя наборами данных статистически значимо не отличался друг от друга в течение 10-минутного периода времени. Значимый порог составляет p < 0,05 (односторонняя ANOVA). Аббревиатура: WT = дикий тип. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительная таблица S1: Данные о гидратации сырой пыльцы, использованные для построения рисунка 7 (пыльца A. thaliana WT Col-0 на стерильном рыльце pA9-барназы самцов). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительное видео S1: Видео, демонстрирующее перенос одного пыльцевого зерна WT (Col-0) на кончике пары щипцов в «девственную» клетку стигматического сосочка (мужская стерильная линия pA9-барназы). Чтобы облегчить доступ к видео, качество изображения было намеренно снижено. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительное видео S2: Видео, демонстрирующее перенос одной пыльцы WT (Col-0) из монослоя пыльцевых зерен на кончике пары щипцов в «девственную» клетку стигматического сосочка (стерильная линия pA9-барназы мужского пола). Чтобы облегчить доступ к видео, качество изображения было намеренно снижено. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Для цветковых растений самые ранние стадии полового размножения, пожалуй, самые важные. На уровне пыльцево-стигматического взаимодействия принимаются молекулярные решения, определяющие «совместимость» взаимодействующих партнеров. Такие решения, если они приняты правильно, позволяют избежать потерь ресурсов, которые могут повлиять на репродуктивную пригодность²¹. Таким образом, разрешение только совместимой пыльцы для оплодотворения является одним из важных компонентов поддержания хорошо адаптированных генотипов и, следовательно, эволюционного успеха видов. Исследования, проведенные с модельным растением A. thaliana, были чрезвычайно ценными для углубления нашего понимания этого процесса. Ряд исследований, проведенных за последние несколько десятилетий, выявил наличие факторов в пыльцевой оболочке, которые действуют на первой «контрольной точке» совместимости, где пыльца получает доступ к стигматической воде, чтобы обеспечить гидратацию пыльцы¹³. Несмотря на это первое понимание механизмов, регулирующих совместимость пыльцы и стигмы, все еще существует много пробелов в нашем понимании этого процесса. На сегодняшний день никакие мутанты переносимых пыльцой лигандов или стигматических рецепторов, которые, как известно, влияют на гидратацию пыльцы, не могут полностью блокировать совместимое опыление, что свидетельствует о наличии других неоткрытых детерминант гидратации пыльцы. Имея возможность легко наблюдать интересующий фенотип, биоанализ гидратации пыльцы, описанный здесь, является одним из самых простых методов изучения потенциальных мутантов, которые регулируют опыление.

Существующие методики измерения гидратации пыльцы обычно используют массовое опыление и сообщают о меньшем количестве временных точек 14,22,23 и, таким образом^, могут упускать важные фенотипы тонкого профиля гидратации. Например, исследование Wang et ^al.13, наряду с работой над другими мутантами белка пыльцевой оболочки в нашей лаборатории (неопубликованные наблюдения), выявило интригующие различия в профилях гидратации между мутантами. Такие тонкие различия могут содержать важные ключи к регуляторным механизмам, лежащим в основе совместимого опыления.

Описанный здесь метод фокусируется на получении относительно небольшого количества измерений между мутантными и WT линиями растений с акцентом на методологическую точность для уменьшения вариаций в наборах данных. Несмотря на то, что этот метод обладает высокой воспроизводимостью (как показано на рисунке 7), при условии, что температура и влажность адекватно контролируются, важно собрать данные о гидратации для почти равного количества WT и мутантной пыльцы в один и тот же день, чтобы еще больше снизить вероятность вариаций. При необходимости данные могут быть объединены в разные дни. Кроме того, выбор подходящих контрольных установок WT имеет жизненно важное значение для правильной интерпретации результатов гидратации. Для реципиента пыльцы следует использовать одну и ту же линию растений для получения как контрольных WT, так и мутантных пыльцевых зерен.

Например, мы используем линию стерильных растений мужского пола pA9-барназы, которая также фигурирует в видеопротоколе, в качестве реципиента пыльцы как для WT (контрольной), так и для мутантной (экспериментальной) пыльцы при исследовании мутантных линий пыльцы Т-ДНК (таких как мутант «KD», описанный на рисунке 8). Следует избегать смешивания данных из такой мужской стерильной линии, которые не должны быть выхолощены, с данными, собранными из выхолощенной вручную контрольной линии, поскольку эти стигмы, вероятно, будут вести себя по-разному. Аналогичным образом, выхолощенные мутантные линии следует использовать в сочетании с выхолощенной WT (контрольной) линией, когда это возможно. Такую же осторожность следует проявлять и при рассмотрении генетического фона исследуемых растений. В то время как большинство популярных коллекций мутантов Т-ДНК были созданы на фоне Col-0, другие, такие как коллекция FLAG от Национального института агрономических исследований (INRA), доступны в генетическом фоне Вассилевской (WS)^24,25. В таких случаях целесообразно использовать линии растений WT соответствующего экотипа в качестве контроля.

Хотя здесь мы сосредоточились на гидратации пыльцы в течение первых 10 минут взаимодействия пыльцы и стигмы, этот метод также может быть адаптирован для охвата профилей гидратации, которые охватывают более длительный период времени. Ключевая особенность протокола заключается в том, что цветы остаются прикрепленными к родительскому растению – опубликованные протоколы обычно требуют вырезания пестика и помещения в среду для поддержания ткани на время эксперимента^14,18,26. Хотя нет прямых доказательств того, что такой полу-природный подход влияет на гидратацию пыльцы или действительно изменяет регуляцию этого процесса in vivo, вполне возможно, что удаление цветов из родительского растения может повлиять на опыление. Таким образом, этот протокол обеспечивает истинную среду in vivo для изучения взаимодействия пыльцы и стигмы, где сохраняется структурная целостность растения.

Перенос одиночных пыльцевых зерен на «девственные» стигматические сосочки, возможно, является одной из самых сложных операций, описанных в этом протоколе. Нередки случаи ошибочного переноса гроздей пыльцевых зерен. Однако вероятность того, что это произойдет, можно значительно уменьшить, убедившись, что на щипцах присутствует только монослой пыльцы (рис. 3А) (или даже только одно пыльцевое зерно; Рисунок 5) и/или путем использования пыльцевых зерен, которые уже ориентированы таким образом, что они «выступают» из других на кончиках щипцов. Мы обнаружили, что опытный оператор может успешно завершить перенос одной пыльцы в клетку стигматического сосочка примерно за 3 минуты и записать данные до пяти пыльцевых зерен в течение 1 часа. Таким образом, в течение 2-4 дней может быть накоплено достаточно данных для содержательного статистического анализа исследуемых линий растений.

Человеческая ошибка потенциально является самым большим источником различий в анализе наборов данных, полученных в результате исследований с использованием этого протокола. Например, определение «границы пыльцы» при анализе изображений сводится к суждению отдельного исследователя. Таким образом, существует вероятность того, что измерения, сделанные разными исследователями, даже на одном и том же наборе данных, могут привести к изменениям. Там, где это возможно, один исследователь должен проводить измерения, чтобы свести к минимуму ошибки выборки. Кроме того, объединение анализа WT и мутантных наборов данных одним и тем же оператором сводит на нет потенциально субъективное определение «границы пыльцы» и межоператорной вариации.

В заключение описан сложный, но точный метод измерения профилей гидратации пыльцы в модельном организме A. thaliana. Мы продемонстрировали, что, используя этот протокол, можно легко получить высокосогласованные данные о гидратации пыльцы A. thaliana. Три независимые партии данных об опылении WT, полученные в разные дни, показали последовательные небольшие отклонения в размере <3% во все моменты времени (рис. 7 и дополнительная таблица S1). Хотя биоанализ, представленный здесь, немного сложнее, чем большинство существующих протоколов, разрешение полученных данных превосходит и подходит для идентификации и характеристики новых мутантов, которые влияют на пути, регулирующие совместимое опыление.

Materials

A9-barnase line	University of Bath	Courtsey of Prof. Rod Scott	Male sterile Arabidopsis thaliana wildtype equivalent line of the ecotype Columbia-0
Dumont Tweezer, Dumont #5 Inox 11cm	Fisher	Dumont 500342	Tweezer uses for transfer of pollen grain
GraphPad Prsim (version 8.0.2)	Dotmatics	Prism	Comprehensive data analysis, graphing and statistics software
JMP (version 17)	JMP Statistical Discovery LLC	JMP 17	Statistical analysis software
Levington F2S seed & modular compost (with sand)	Levington	LEV75F2SMS	General-purpose compost for plant growth
Micromanipulator	Singer instrument Co. LTD.	Singer Micromanipulator	Micromanipulator to aid transfer of pollen grain
Nikon Digit sight DS-U1	Nikon	DS-U1	Microscope camera (coupletd to SMZ1500)
Nikon Eclipse TE2000-S Inverted Microscope	Nikon	TE2000-S	Inverted microscope
Nikon SMZ1500 Stereomicroscope	Nikon	SMZ1500	Stereomicroscope
Nikon DS-Fi3 microscope camera	Nikon	DS-Fi3	Microscope camera (coupletd to TE2000-S)
Nikon NIS-Elements Basic Research	Nikon	NIS-Elements BR	Image accquisition and analysis software (for DS-Fi3)
Nikon NIS-Elements F	Nikon	NIS-Elements F	Image accquisition and analysis software (for DS-U1)
WT Col-0 plant line	NASC	N700000	Wildtype Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0