זילוח דם מהיר יעיל בקסנופוס
Summary
מוצג כאן פרוטוקול יעיל של זילוח דם מהיר להכנת דגימות רקמה מצפרדעים אפריקאיות בעלות טפרים למחקרי שעתוק ופרוטאומיקה.
Abstract
קסנופוס הם יצורי מודל רבי עוצמה להבנת התפתחות ומחלות של בעלי חוליות כבר למעלה מ-100 שנה. כאן מוגדר פרוטוקול זילוח דם מהיר בקסנופוס, שמטרתו הפחתה עקבית ודרסטית של הדם בכל הרקמות. הזלוף מתבצע על ידי החדרת מחט ישירות לחדר הלב ושאיבת מלח חוצץ פוספט (PBS) דרך מערכת כלי הדם. ניתן להשלים את ההליך תוך כ -10 דקות לכל חיה. הדם נשלט על ידי כמה חלבונים וסוגי תאים נפוצים מאוד, מה שיוצר בעיות רבות מכיוון שחלבונים אלה מסווים את רוב המולקולות וסוגי התאים האחרים המעניינים. האפיון הניתן לשחזור של רקמות קסנופוס בוגרות עם פרוטאומיקה כמותית ושעתוק חד-תאי יפיק תועלת מיישום פרוטוקול זה לפני דגימת האיברים. הפרוטוקולים לדגימת רקמות מוגדרים בניירות נלווים. נהלים אלה מכוונים לסטנדרטיזציה של פרקטיקות ברחבי Xenopus של מין, גיל ומצב בריאותי שונים, במיוחד X. laevis ו– X. tropicalis.
Introduction
זילוח הגוף כולו של דו-חיים מתבצע באופן שגרתי לצורך שימור וקיבוע 1,2,3,4,5,6. עם זאת, הליכים אלה מתרחשים בקצב המגביל את מספר הדגימות הטריות שניתן לקחת לכל חיה. מטרת עבודה זו היא לפתח פרוטוקול זילוח דם יעיל בקסנופוס, תוך מתן עדיפות למהירות הטכניקה. הפרוטוקול לוקח פחות מ-10 דקות לכל חיה עבור X. tropicalis ופחות מ-15 דקות לכל X. laevis חיה. סדרי העדיפויות המשניים הם קלות השכפול והשימוש בציוד שנרכש בקלות, כך שניתן יהיה לשתף דגימות באיכות גבוהה באופן נרחב בין מעבדות Xenopus.
צפרדעי קסנופוס נמצאות בשימוש נרחב במחקר ביו-רפואי כדי לחקור תהליכים ביולוגיים ופתולוגיים בסיסיים שנשמרו בין מינים. לטטרפוד זה יש קשר אבולוציוני קרוב יותר עם יונקים מאשר מודלים ימיים אחרים, ויש לו ריאות, לב בעל שלושה חדרים וגפיים עם ספרות. הקהילה הבינלאומית משתמשת ביעילות ב– Xenopus כדי להשיג הבנה עמוקה יותר של מחלות אנושיות באמצעות מודלים מעמיקים של מחלות וניתוח מולקולרי של תפקוד גנים הקשורים למחלות. היתרונות הרבים של קסנופוס כמודל של בעלי חיים הופכים אותם לכלים יקרי ערך לחקר הבסיס המולקולרי של התפתחות אנושית ומחלות; יתרונות אלה כוללים: גודל ביציות ועובר גדול, פריון גבוה, קלות דיור, התפתחות חיצונית מהירה וקלות מניפולציה גנומית. ההערכה היא כי Xenopus חולקים ~80% מהגנים המזוהים של המחלה האנושית7.
בהשוואה למודלים פופולריים של יונקים, Xenopus הוא מודל מהיר וחסכוני, עם קלות של הפלת מורפולינו וזמינות של טרנסגניות יעילות ומוטציות גנטיות ממוקדות באמצעות CRISPR8. ספקטרומטריית מסה כמותית ושעתוק חד-תאי יושמו בהצלחה על עוברי Xenopus9,10, אך אטלס תאים עדכני של Xenopus laevis מראה כי הרכב רוב הרקמות נשלט על ידי סוגי תאי דם 11. על ידי פיתוח טכניקה המשחררת רקמות בקצב מהיר ושימוש במדיה צוננת, טריות הדגימה מושפעת באופן מינימלי מזילוח. זה חשוב במיוחד עבור יישומים שבהם המטרה היא פרופיל mRNA או ביטוי חלבון שאינם מוטרדים פיזיולוגית.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר טכניקות דיסקציה מסורתיות לגישה לחלל הקואלומי. טכניקות אחרות מקובלות גם כן, בתנאי שהן גורמות נזק מינימלי לרקמות, הלב נגיש, והריאה והקיבה גלויים. באופן דומה, ניתן להחליף בקלות את רוב כלי הדיסקציה המפורטים בפריטים דומים.
בעוד שנעשו ניסיונות לייעל את היעילות של…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק OD R24 של NIH OD031956 ומענק NICHD R01 HD073104. אנו מודים לדארסי קלי על דיונים מועילים וקלט ראשוני על פרוטוקול זה. ברצוננו גם להודות לסמנתה ג’לברט, ג’יל רלסטון וויל רצן על עזרתם ותמיכתם, כמו גם לשלושת הסוקרים העמיתים האנונימיים שלנו על המשוב שלהם.
Materials
| 5x Magnifying glass with LED light and stand | amazon.com | B08QJ6J8P1 | light must not produce heat |
| Disposable transfer pipets | VWR | 414004-036 | |
| Dissecting fine-pointed forceps | Fisher Scinetific | 08-875 | |
| Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5" | VWR | 76457-374 | |
| Dissection tray | Fisher Scinetific | 14-370-284 | styrofoam sheets are an acceptable alternative |
| Euthanasia container | US Plastic | Item 2860 | alternative opaque containers acceptable |
| Euthanasia container lid | US Plastic | Item 3047 | |
| Fine dissection pins | Living Systems Instrumentation | PIN-#3 | |
| General use hypodermic needles, 22 G | Fisher Scientific | 14-826-5A | for X. laevis |
| General use hypodermic needles, 25 G | Fisher Scientific | 14-826AA | for X. tropicalis |
| Heparin, porcine intestinal mucosa | MilliporeSigma | 37-505-410MG | |
| Iridectomy scissors 6" | vwr | 470018-938 | iris scissors are an acceptable alternative |
| Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring | amazon.com | B09PTX6M2Z | size will be dependant on the hosing of the pump used |
| Mayo-Hegar needle holder | Fisher Scinetific | 08-966 | mosquito forceps are an acceptable alternative |
| MS-222: Syncaine (formerly tricaine) | Pentair AES | TRS1 | |
| PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Peristaltic liquid pump dosing pump 5–100 mL/min | amazon.com | B07PWY4SM6 | any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable |
| Sharpening stone | VWR | 470150-112 | optional; for dulling needles |
| Sodium bicarbonate, powder, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Specimen forceps, serrated | VWR | 82027-442 | |
| T-Pins for dissecting | Fisher Scinetific | S99385 | |
| Ultra-fine short insulin syringes, 31 G | VWR | BD328438 | |
| Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp & powerful side cutter clippers | amazon.com | B087P191LP |
Referências
- Saltman, A. J., Barakat, M., Bryant, D. M., Brodovskaya, A., Whited, J. L. DiI perfusion as a method for vascular visualization in Ambystoma mexicanum. Journal of Visualized Experiments. (124), e55740 (2017).
- Lametschwandtner, A., Minnich, B. Microvascular anatomy of the brain of the adult pipid frog, Xenopus laevis (Daudin): A scanning electron microscopic study of vascular corrosion casts. Journal of Morphology. 279 (7), 950-969 (2018).
- Lametschwandtner, A., Minnich, B. Microvascular anatomy of the urinary bladder in the adult African clawed toad, Xenopus laevis: A scanning electron microscope study of vascular casts. Journal of Morphology. 282 (3), 368-377 (2021).
- Lametschwandtner, A., et al. Microvascular anatomy of the gallbladder of the adult South African clawed toad, Xenopus laevis Daudin: A scanning electron microscope study of vascular corrosion casts. Microscopy and Microanalysis. 13, 492-493 (2007).
- Lametschwandtner, A., Spornitz, U., Minnich, B. Microvascular anatomy of the non-lobulated liver of adult Xenopus laevis: A scanning electron microscopic study of vascular casts. Anatomical Record. 305 (2), 243-253 (2022).
- Miodoński, A. J., Bär, T. Arterial supply of the choriocapillaris of anuran amphibians (Rana temporaria, Rana esculenta). Scanning electron-microscopic (SEM) study of microcorrosion casts. Cell and Tissue Research. 249 (1), 101-109 (1987).
- Nenni, M. J., et al. Xenbase: Facilitating the use of Xenopus to model human disease. Frontiers in Physiology. 10, 154 (2019).
- Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Biologia do Desenvolvimento. 426 (2), 325-335 (2017).
- Peshkin, L., et al. The protein repertoire in early vertebrate embryogenesis. bioRxiv. , (2019).
- Briggs, J. A., et al. The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution. Science. 360 (6392), (2018).
- Liao, Y., et al. Cell landscape of larval and adult Xenopus laevis at single-cell resolution. Nature Communications. 13 (1), 4306 (2022).
- AVMA (American Veterinary Medical Association). AVMA guidelines for the euthanasia of animals, 2020 edition. AVMA. , 37 (2020).
- Navarro, K., Jampachaisri, K., Chu, D., Pacharinsak, C. Bupivacaine as a euthanasia agent for African Clawed Frogs (Xenopus laevis). PLoS One. 17 (12), e0279331 (2022).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988 (2021).
- Heinz-Taheny, K. M. Cardiovascular physiology and diseases of amphibians. Veterinary clinics of North America. The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 12 (1), 39-50 (2009).
- Stephenson, A., Adams, J. W., Vaccarezza, M. The vertebrate heart: an evolutionary perspective. Journal of Anatomy. 231 (6), 787-797 (2017).
- Hoops, D. A perfusion protocol for lizards, including a method for brain removal. MethodsX. 2, 165-173 (2015).
