Summary
Presentert her er en effektiv rask blodperfusjonsprotokoll for å forberede vevsprøver fra afrikanske klørfrosker for transkriptomikk og proteomikkstudier.
Abstract
Xenopus har vært kraftige modellorganismer for å forstå virveldyrutvikling og sykdom i over 100 år. Her defineres en rask blodperfusjonsprotokoll i Xenopus, rettet mot en konsistent og drastisk reduksjon av blod i alle vev. Perfusjon utføres ved å sette en nål direkte inn i hjertets ventrikkel og pumpe heparinisert fosfatbufret saltvann (PBS) gjennom det vaskulære systemet. Prosedyren kan fullføres på ca. 10 minutter per dyr. Blodet domineres av noen få svært rikelig proteiner og celletyper, noe som skaper mange problemer da disse proteinene maskerer de fleste andre molekyler og celletyper av interesse. Den reproduserbare karakteriseringen av voksne Xenopus-vev med kvantitativ proteomikk og enkeltcelletranskriptomikk vil ha nytte av å anvende denne protokollen før organprøvetaking. Protokollene for vevsprøvetaking er definert i ledsagerpapir. Disse prosedyrene er rettet mot standardisering av praksis på tvers av Xenopus av forskjellig kjønn, alder og helsestatus, spesielt X. laevis og X. tropicalis.
Introduction
Hele kroppens perfusjon av amfibier er rutinemessig fullført med henblikk på bevaring og fiksering 1,2,3,4,5,6. Imidlertid skjer disse prosedyrene med en hastighet som begrenser antall ferske prøver som kan tas per dyr. Målet med dette arbeidet er å utvikle en effektiv blodperfusjonsprotokoll i Xenopus, og prioritere teknikkens hastighet. Protokollen tar mindre enn 10 min per dyr for X. tropicalis og mindre enn 15 min per X. laevis dyr. De sekundære prioriteringene er enkel replikering og bruk av lett anskaffet utstyr, slik at prøver av høy kvalitet kan deles mye mellom Xenopus-laboratorier.
Xenopus frosker brukes mye i biomedisinsk forskning for å studere grunnleggende biologiske og patologiske prosesser bevart på tvers av arter. Denne tetrapoden har et nærmere evolusjonært forhold til pattedyr enn andre akvatiske modeller, og har lunger, et trekammerhjerte og lemmer med sifre. Det internasjonale samfunnet bruker effektivt Xenopus for å få en dypere forståelse av menneskelig sykdom gjennom grundig sykdomsmodellering og molekylær analyse av sykdomsrelatert genfunksjon. De mange fordelene med Xenopus som dyremodell gjør dem uvurderlige verktøy for å studere det molekylære grunnlaget for menneskelig utvikling og sykdom; Disse fordelene inkluderer: stor oocytt- og embryostørrelse, høy fruktbarhet, enkel bolig, rask ekstern utvikling og enkel genomisk manipulasjon. Xenopus har blitt anslått å dele ~ 80% av de identifiserte menneskelige sykdomsgenene7.
Sammenlignet med populære pattedyrmodeller er Xenopus en rask, kostnadseffektiv modell, med enkel morfolino-nedslag og tilgjengeligheten av effektive transgene og målrettede genmutasjoner ved bruk av CRISPR8. Kvantitativ massespektrometri og encellet transkriptomikk har blitt brukt med hell på Xenopus-embryoer9,10, men et nylig celleatlas fra Xenopus laevis viser at sammensetningen av de fleste vev domineres av blodcelletyper11. Ved å utvikle en teknikk som ekssanguinerer vev i rask hastighet og ved bruk av kjølte medier, påvirkes prøvens friskhet minimalt av perfusjon. Dette er spesielt viktig for applikasjoner der målet er å profilere fysiologisk uforstyrret mRNA eller proteinuttrykk.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen beskriver tradisjonelle disseksjonsteknikker for tilgang til coelomic cavity. Andre teknikker er også akseptable, forutsatt at de forårsaker minimal skade på vevet, hjertet er tilgjengelig, og lungen og magen er synlige. På samme måte kan de fleste disseksjonsverktøy som er oppført, enkelt erstattes med sammenlignbare elementer.
Mens forsøk har blitt gjort for å optimalisere effekten av denne prosedyren, kan resultatene variere avhengig av ens erfaring og variabilite…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av NIHs OD R24 grant OD031956 og NICHD R01 grant HD073104. Vi takker Darcy Kelly for nyttige diskusjoner og innledende innspill til denne protokollen. Vi vil også takke Samantha Jalbert, Jill Ralston og Wil Ratzan for deres hjelp og støtte, samt våre tre anonyme fagfeller for deres tilbakemeldinger.
Materials
| 5x Magnifying glass with LED light and stand | amazon.com | B08QJ6J8P1 | light must not produce heat |
| Disposable transfer pipets | VWR | 414004-036 | |
| Dissecting fine-pointed forceps | Fisher Scinetific | 08-875 | |
| Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5" | VWR | 76457-374 | |
| Dissection tray | Fisher Scinetific | 14-370-284 | styrofoam sheets are an acceptable alternative |
| Euthanasia container | US Plastic | Item 2860 | alternative opaque containers acceptable |
| Euthanasia container lid | US Plastic | Item 3047 | |
| Fine dissection pins | Living Systems Instrumentation | PIN-#3 | |
| General use hypodermic needles, 22 G | Fisher Scientific | 14-826-5A | for X. laevis |
| General use hypodermic needles, 25 G | Fisher Scientific | 14-826AA | for X. tropicalis |
| Heparin, porcine intestinal mucosa | MilliporeSigma | 37-505-410MG | |
| Iridectomy scissors 6" | vwr | 470018-938 | iris scissors are an acceptable alternative |
| Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring | amazon.com | B09PTX6M2Z | size will be dependant on the hosing of the pump used |
| Mayo-Hegar needle holder | Fisher Scinetific | 08-966 | mosquito forceps are an acceptable alternative |
| MS-222: Syncaine (formerly tricaine) | Pentair AES | TRS1 | |
| PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Peristaltic liquid pump dosing pump 5–100 mL/min | amazon.com | B07PWY4SM6 | any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable |
| Sharpening stone | VWR | 470150-112 | optional; for dulling needles |
| Sodium bicarbonate, powder, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Specimen forceps, serrated | VWR | 82027-442 | |
| T-Pins for dissecting | Fisher Scinetific | S99385 | |
| Ultra-fine short insulin syringes, 31 G | VWR | BD328438 | |
| Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp & powerful side cutter clippers | amazon.com | B087P191LP |
Referências
- Saltman, A. J., Barakat, M., Bryant, D. M., Brodovskaya, A., Whited, J. L. DiI perfusion as a method for vascular visualization in Ambystoma mexicanum. Journal of Visualized Experiments. (124), e55740 (2017).
- Lametschwandtner, A., Minnich, B. Microvascular anatomy of the brain of the adult pipid frog, Xenopus laevis (Daudin): A scanning electron microscopic study of vascular corrosion casts. Journal of Morphology. 279 (7), 950-969 (2018).
- Lametschwandtner, A., Minnich, B. Microvascular anatomy of the urinary bladder in the adult African clawed toad, Xenopus laevis: A scanning electron microscope study of vascular casts. Journal of Morphology. 282 (3), 368-377 (2021).
- Lametschwandtner, A., et al. Microvascular anatomy of the gallbladder of the adult South African clawed toad, Xenopus laevis Daudin: A scanning electron microscope study of vascular corrosion casts. Microscopy and Microanalysis. 13, 492-493 (2007).
- Lametschwandtner, A., Spornitz, U., Minnich, B. Microvascular anatomy of the non-lobulated liver of adult Xenopus laevis: A scanning electron microscopic study of vascular casts. Anatomical Record. 305 (2), 243-253 (2022).
- Miodoński, A. J., Bär, T. Arterial supply of the choriocapillaris of anuran amphibians (Rana temporaria, Rana esculenta). Scanning electron-microscopic (SEM) study of microcorrosion casts. Cell and Tissue Research. 249 (1), 101-109 (1987).
- Nenni, M. J., et al. Xenbase: Facilitating the use of Xenopus to model human disease. Frontiers in Physiology. 10, 154 (2019).
- Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Biologia do Desenvolvimento. 426 (2), 325-335 (2017).
- Peshkin, L., et al. The protein repertoire in early vertebrate embryogenesis. bioRxiv. , (2019).
- Briggs, J. A., et al. The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution. Science. 360 (6392), (2018).
- Liao, Y., et al. Cell landscape of larval and adult Xenopus laevis at single-cell resolution. Nature Communications. 13 (1), 4306 (2022).
- AVMA (American Veterinary Medical Association). AVMA guidelines for the euthanasia of animals, 2020 edition. AVMA. , 37 (2020).
- Navarro, K., Jampachaisri, K., Chu, D., Pacharinsak, C. Bupivacaine as a euthanasia agent for African Clawed Frogs (Xenopus laevis). PLoS One. 17 (12), e0279331 (2022).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988 (2021).
- Heinz-Taheny, K. M. Cardiovascular physiology and diseases of amphibians. Veterinary clinics of North America. The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 12 (1), 39-50 (2009).
- Stephenson, A., Adams, J. W., Vaccarezza, M. The vertebrate heart: an evolutionary perspective. Journal of Anatomy. 231 (6), 787-797 (2017).
- Hoops, D. A perfusion protocol for lizards, including a method for brain removal. MethodsX. 2, 165-173 (2015).
