Optimalisatie van prestatieparameters van de TAGGG-telomeerlengtetest
Summary
Hier beschrijven we in detail het protocol voor het kwantificeren van de telomeerlengte met behulp van niet-radioactieve chemiluminescente detectie, met een focus op de optimalisatie van verschillende prestatieparameters van de TAGGG-telomeerlengtetestkit, zoals bufferhoeveelheden en sondeconcentraties.
Abstract
Telomeren zijn repetitieve sequenties die aanwezig zijn aan chromosomale uiteinden; Hun verkorting is een kenmerkend kenmerk van menselijke somatische cellen. Verkorting treedt op als gevolg van een probleem met eindreplicatie en de afwezigheid van het telomerase-enzym, dat verantwoordelijk is voor het behoud van de telomeerlengte. Interessant is dat telomeren ook korter worden als reactie op verschillende interne fysiologische processen, zoals oxidatieve stress en ontsteking, die kunnen worden beïnvloed door extracellulaire agentia zoals verontreinigende stoffen, infectieuze agentia, voedingsstoffen of straling. Telomeerlengte dient dus als een uitstekende biomarker van veroudering en verschillende fysiologische gezondheidsparameters. De TAGGG telomeerlengtetestkit wordt gebruikt om gemiddelde telomeerlengtes te kwantificeren met behulp van de telomeerrestrictiefragment (TRF) -test en is zeer reproduceerbaar. Het is echter een dure methode en daarom wordt het niet routinematig gebruikt voor grote steekproefaantallen. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor een geoptimaliseerde en kosteneffectieve meting van de telomeerlengte met behulp van Southern blots of TRF-analyse en niet-radioactieve chemiluminescentie-gebaseerde detectie.
Introduction
Telomeren zijn de repetitieve DNA-sequenties die aanwezig zijn aan het einde van chromosomen. Ze hebben tandemherhalingen van TTAGGG en behouden de integriteit van het genoom door het chromosoom te beschermen tegen zowel rafels als het eindreplicatieprobleem, wat betekent dat een deel van de 3′-overhang niet kan worden gerepliceerd door DNA-polymerase 1,2. Korte telomeren leiden tot chromosomale afwijkingen in cellen, waardoor cellen permanent worden gestopt in een stadium dat replicatieve senescentie3 wordt genoemd. Korte telomeren veroorzaken ook een groot aantal andere problemen, zoals mitochondriale disfunctie 4,5 en celdisfunctie.
DNA-telomerische herhalingen gaan verloren als en wanneer de cel zich deelt, met een gemiddeld verlies van 25 tot 200 bp per jaar 6, wat resulteert in cellulaire senescentie na een bepaald aantal delingen6. Veroudering is geassocieerd met een hogere frequentie van comorbiditeiten, die wordt gekenmerkt door een verkorting van de telomeerlengte7. Telomere restriction fragment (TRF) analyse, zoals beschreven door Mender, is een zeer dure methode8. Hierdoor wordt het in de meeste onderzoeken niet geïmplementeerd bij het kwantificeren van de telomeerlengte.
Momenteel maken de meeste epidemiologische studies gebruik van kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) -gebaseerde metingen van telomeerlengte. De op qPCR gebaseerde methode is echter een relatieve meetmethode, omdat deze de verhouding meet tussen telomeren en single-copy gen-amplificatieproducten, en niet de absolute telomeerlengte. Telomeerlengtemeting met behulp van het TRF-protocol is de gouden standaardmethode, omdat het de telomeerlengteverdeling in het monster kan meten en metingen kunnen worden uitgedrukt in absolute waarden in kilobases (kb). Het gebruik ervan is echter beperkt omdat het omslachtig, arbeidsintensief en duur is. Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor telomeerlengtemeting met behulp van op chemiluminescentie gebaseerde TRF’s.
TRF-analyse omvat zeven belangrijke stappen: 1) kweken van cellen voor genomische DNA-extractie, 2) genomische DNA-extractie met behulp van de fenol: chloroform: isoamylalcohol (P: C: I) -methode, 3) restrictievertering van genomisch DNA, 4) agarosegel-elektroforese, 5) Zuidelijk blotting van het DNA-fragment van de restrictievertering, 6) hybridisatie en detectie via chemiluminescentie-de geïmmobiliseerde telomeersonde wordt gevisualiseerd door een zeer gevoelig chemiluminescent substraat voor alkalische fosfatase, dinatrium 2-chloor-5-(4-methoxyspiro[1,2-dioxetane-3,2′-(5-chlorotricyclo[3.3.1.13.7]decan])-4-yl]-1-fenylfosfaat (CDP-Star)-en 7) analyse voor het verkrijgen van gemiddelde telomeerlengte- en bereikinformatie van deze telomerische uitstrijkjes.
Protocol
Representative Results
Discussion
We beschrijven een gedetailleerde procedure voor een niet-radioactieve, op chemiluminescentie gebaseerde methode voor telomeerlengtemeting met behulp van Southern blotting. Het protocol is getest om het oordeelkundig gebruik van verschillende reagentia mogelijk te maken zonder afbreuk te doen aan de kwaliteit van de resultaten. De prehybridisatie- en hybridisatiebuffer kan tot vijf keer worden hergebruikt. De enzymconcentratie kan variëren tussen 10-20 U per 1,5-2 μg genomisch DNA zonder de resultaten te beïnvloeden. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen mevrouw Prachi Shah bedanken voor het feit dat ze ons in eerste instantie heeft geholpen met de protocoloptimalisatie. We willen Dr. Manoj Garg bedanken voor het leveren van de A2780 eierstokkanker cellijn. EK wordt ondersteund door een onderzoekssubsidie van het Department of Biotechnology (No. BT / RLF / Re-entry / 06/2015), Department of Science and Technology (ECR / 2018 / 002117) en NMIMS Seed Grant (IO 401405).
Materials
| Cell Line | |||
| A2780 (Ovarian adenocarcinoma cell line) | Received as a gift | ||
| Equipment | |||
| ChemiDoc XRS+ (for imaging and UV cross linking) | Biorad | Universal hood II (721BR14277) | |
| Nanodrop (Epoch 2) | Biotek | EPOCH2 | |
| Software | |||
| TeloTool | Version 1.3 | ||
| Materials | |||
| Acetic Acid | Molychem | 64-19-7 | |
| Agarose | MP | 180720 | |
| Amphotericin B | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| DMEM | HyClone, Cytiva, USA | SH30243.01 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | Molychem | 6381-92-6 | |
| HI FBS | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 10270106 | |
| HCl | Molychem | 76-47-01-0 | |
| NaCl | Molychem | 7647-14-5 | |
| NaOH | Molychem | 1310-73-2 | |
| Nylon membrane | Sigma | 11209299001 | |
| Penicillin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Affymetrix | 151-21-3 | |
| Streptomycin | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 15240062 | |
| Tris | BIORAD | 77-86-1 | |
| Tris HCl | Sigma Aldrich | 1185-53-1 | |
| Whatman paper | GE healthcare lifesciences | 1001-917 | |
| Reagents | |||
| 1 kb ladder | NEB | N3232S | |
| 20x SSC | Invitrogen | 15557-036 | |
| Anti DIG AP | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Blocking solution 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Cutsmart Buffer | NEB | B6004 | |
| Detection buffer 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Dig easy hyb | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Digestion Buffer | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Hinf 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Hinf 1 (alternative to kit) | NEB | R0155T | |
| Loading Dye | BIOLABS | N3231S | |
| Maleic acid buffer 10x | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Molecular marker | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Probe | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Rsa 1 | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Rsa 1 (alternative to kit) | NEB | R0167L | |
| Substrate | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 | |
| Wash buffer | Telo TAGGG Telomere Length Assay kit | 12209136001 |
Referências
- Greider, C. W. Telomere length regulation. Annual Review of Biochemistry. 65, 337-365 (1996).
- Valdes, A. M., et al. Obesity, cigarette smoking, and telomere length in women. Lancet. 366 (9486), 662-664 (2005).
- Allsopp, R. C., et al. Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (21), 10114-10118 (1992).
- Epel, E. S., et al. Accelerated telomere shortening in response to life stress. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (49), 17312-17315 (2004).
- Canela, A., Vera, E., Klatt, P., Blasco, M. A. High-throughput telomere length quantification by FISH and its application to human population studies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (13), 5300-5305 (2007).
- Révész, D., Milaneschi, Y., Verhoeven, J. E., Penninx, B. W. Telomere length as a marker of cellular aging is associated with prevalence and progression of metabolic syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 99 (12), 4607-4615 (2014).
- Rizvi, S., Raza, S. T., Mahdi, F. Telomere length variations in aging and age-related diseases. Current Aging Science. 7 (3), 161-167 (2014).
- Mender, I., Shay, J. W. Telomere restriction fragment (TRF) analysis. Bio-Protocol. 5 (22), e1658 (2015).
- Zhu, Y., Liu, X., Ding, X., Wang, F., Geng, X. Telomere and its role in the aging pathways: telomere shortening, cell senescence and mitochondria dysfunction. Biogerontology. 20 (1), 1-16 (2019).
- Göhring, J., Fulcher, N., Jacak, J., Riha, K. TeloTool: a new tool for telomere length measurement from terminal restriction fragment analysis with improved probe intensity correction. Nucleic Acids Research. 42 (3), 21 (2014).
- Jenkins, F. J., Kerr, C. M., Fouquerel, E., Bovbjerg, D. H., Opresko, P. L. Modified terminal restriction fragment analysis for quantifying telomere length using in-gel hybridization. Journal of Visualized Experiments. (125), e56001 (2017).
- Fojtová, M., Fajkus, P., Sováková, P. P., Fajkus, J. Terminal restriction fragments (TRF) method to analyze telomere lengths. Bio-protocol. 5 (23), e1671 (2015).
- Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nature Protocols. 5 (9), 1596-1607 (2010).
- Trigodet, F., et al. High molecular weight DNA extraction strategies for long-read sequencing of complex metagenomes. Molecular Ecology Resources. 22 (5), 1786-1802 (2022).
- Lai, T. P., Wright, W. E., Shay, J. W. Comparison of telomere length measurement methods. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 373 (1741), 20160451 (2018).
- Mochida, A., et al. Telomere size and telomerase activity in Epstein-Barr virus (EBV)-positive and EBV-negative Burkitt’s lymphoma cell lines. Archives of Virology. 150 (10), 2139-2150 (2005).
- Gupta, N., et al. Replicative senescence, telomere shortening and cell proliferation rate in Gaddi goat’s skin fibroblast cell line. Cell Biology International. 31 (10), 1257-1264 (2007).
- Michaeli, J., et al. Leukocyte telomere length correlates with extended female fertility. Cells. 11 (3), 513 (2022).
- Lesmana, A., et al. Continuous reference intervals for leukocyte telomere length in children: the method matters. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 59 (7), 1279-1288 (2021).
