यह प्रोटोकॉल बताता है कि उच्च सटीकता, उच्च रिज़ॉल्यूशन और उच्च थ्रूपुट के साथ 3 डी इमेजिंग प्राप्त करने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल क्रिस्टे का पुनर्निर्माण कैसे करें।
सेल ऑर्गेनेल अल्ट्रास्ट्रक्चर की गतिशील विशेषताओं को समझना, जो न केवल अज्ञात जानकारी में समृद्ध है, बल्कि त्रि-आयामी (3 डी) परिप्रेक्ष्य से परिष्कृत भी है, यांत्रिक अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) अच्छी इमेजिंग गहराई प्रदान करता है और नैनोमीटर पैमाने पर भी सेलुलर ऑर्गेनेल की अल्ट्रास्ट्रक्चरल आकृति विज्ञान की जांच करने के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवि ढेर के पुनर्निर्माण की अनुमति देता है; इसलिए, 3 डी पुनर्निर्माण अपने अतुलनीय फायदों के कारण महत्व प्राप्त कर रहा है। स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) एक उच्च-थ्रूपुट छवि अधिग्रहण तकनीक प्रदान करता है जो लगातार स्लाइस में रुचि के एक ही क्षेत्र से 3 डी में बड़ी संरचनाओं के पुनर्निर्माण की अनुमति देता है। इसलिए, ऑर्गेनेल के सच्चे 3 डी अल्ट्रास्ट्रक्चर को बहाल करने के लिए बड़े पैमाने पर 3 डी पुनर्निर्माण में एसईएम का आवेदन तेजी से आम होता जा रहा है। इस प्रोटोकॉल में, हम अग्नाशय के कैंसर कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल क्रिस्टे का अध्ययन करने के लिए सीरियल अल्ट्राथिन सेक्शन और 3 डी पुनर्निर्माण तकनीकों के संयोजन का सुझाव देते हैं। इन तकनीकों का प्रदर्शन कैसे किया जाता है, इसका विवरण इस प्रोटोकॉल में चरण-दर-चरण तरीके से वर्णित किया गया है, जिसमें ऑस्मियम-थियोकार्बोहाइड्राज़ाइड-ऑस्मियम (ओटीओ) विधि, सीरियल अल्ट्राथिन सेक्शन इमेजिंग और विज़ुअलाइज़ेशन डिस्प्ले शामिल हैं।
माइटोकॉन्ड्रिया कोशिका में सबसे महत्वपूर्ण जीवों में से एक हैं। वे सेलुलर बायोएनर्जेटिक और चयापचय 1,2 के केंद्रीय केंद्र के रूप में काम करते हैं और कैंसर3 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। अग्नाशय का कैंसर (पीसी) अपने तेजी से प्रसार और उच्च मृत्यु दर के कारण इलाज के लिए सबसे कठिन कैंसर4 में से एक है। माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन, जो मुख्य रूप से माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान 3,5,6,7 में परिवर्तन के कारण होता है, को पीसी 8 के अंतर्निहित रोग तंत्र से जोड़ा गया है। माइटोकॉन्ड्रिया भी अत्यधिक गतिशील हैं, जो उनके नेटवर्क कनेक्टिविटी और क्रिस्टे संरचना9 में लगातार और गतिशील परिवर्तनों से परिलक्षित होता है। क्रिस्टे संरचना का पुनर्निर्माण सीधे माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन और सेलुलर अवस्था 10,11 को प्रभावित कर सकता है, जो ट्यूमर सेल के विकास, मेटास्टेसिस और ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट परिवर्तन12,13 के दौरान काफी बदल जाते हैं।
हाल के वर्षों में, वैज्ञानिकों ने ईएम अवलोकन14,15,16,17 का उपयोग करके इस ऑर्गेनेल का अध्ययन किया है; उदाहरण के लिए, शोधकर्ताओं ने 3 डी पुनर्निर्माण तकनीक 6,7,18,19 का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता का विश्लेषण किया है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों के 3 डी पुनर्निर्माण के लिए सामान्य अवधारणा और विधि औपचारिक रूप से 196820 की शुरुआत में स्थापित की गई थी और इसमें टी 4 फेज पूंछ के पुनर्निर्माण के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, इलेक्ट्रॉन विवर्तन और कंप्यूटर छवि प्रसंस्करण का संयोजन शामिल था। अब तक, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 3 डी इमेजिंग तकनीक ने छवि संकल्प 21, स्वचालनकी डिग्री 22, और प्रसंस्करण मात्रा 23 के संदर्भ में महत्वपूर्ण प्रगति की है और इसका उपयोग जैविक अनुसंधान में तेजी से व्यापक पैमाने पर किया गया है, ऊतक स्तर से नैनोमीटर स्केल24 पर ऑर्गेनेल अल्ट्रास्ट्रक्चर स्तर तक। हाल के वर्षों में, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 3 डी इमेजिंग भी अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए एक आशाजनक तकनीक बन गई है25,26,27.
माइटोकॉन्ड्रियल क्रिस्टे पर बढ़ता ध्यान विशेष रूप से अल्ट्रास्ट्रक्चरल वॉल्यूम इमेजिंग के लिए आवश्यक आवश्यकताओं को दर्शाता है। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) का उपयोग कॉपर ग्रिड (400 जाल)28 पर एकत्र किए गए नमूनों की कल्पना करने के लिए किया गया है, जिसमें इलेक्ट्रॉन बीम खंड से गुजरता है। हालांकि, कॉपर ग्रिड की सीमित सीमा के कारण, एक ही नमूने29 के निरंतर स्लाइस को पूरी तरह से चित्रित करना असंभव है। यह टीईएम इमेजिंग के दौरान लक्ष्य संरचनाओं के अध्ययन को जटिल बनाता है। इसके अतिरिक्त, टीईएम समय लेने वाले और त्रुटि-प्रवण मैनुअल कार्यों पर निर्भर करता है, जिसमें कई स्लाइस काटना और इकट्ठा करना और उन्हें क्रमिक रूप सेइमेजिंग करना शामिल है, इसलिए इसे बड़ी मात्रा के नमूनोंके अल्ट्रास्ट्रक्चरल पुनर्निर्माण के लिए अनुकूलित नहीं किया गया है। वर्तमान में, बड़ी मात्रा में नमूना इमेजिंग का उच्च-रिज़ॉल्यूशन पुनर्निर्माण विशेष उपकरणों के उपयोग के माध्यम से प्राप्त किया जाता है, जैसे कि टीईएम कैमरा सरणी (टीईएमसीए) 30 या दो दूसरी पीढ़ी के टीईएमसीए सिस्टम (टीईएमसीए 2)31, जो थोड़े समय में स्वचालित उच्च-थ्रूपुट इमेजिंग को सक्षम करते हैं। हालांकि, इस प्रकार की इमेजिंग को अनुकूलित उपकरणों की आवश्यकता के कारण प्राप्त करना आसान और सार्वभौमिक होने का लाभ नहीं है।
टीईएम की तुलना में, एसईएम 32,33 के आधार पर बड़े क्षेत्रों के लिए स्वचालित रूप से हजारों सीरियल वॉल्यूमेट्रिक छवियों को उत्पन्न करने की विधि सीरियल इमेजिंग की दक्षता और विश्वसनीयता को बढ़ाती है और उच्च जेड-रिज़ॉल्यूशन34 प्रदान करती है। उदाहरण के लिए, सीरियल ब्लॉक-फेस स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसबीएफ-एसईएम) और केंद्रित आयन बीम स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एफआईबी-एसईएम) दोनों ने उच्च गति, दक्षता और संकल्प35,36 के साथ अल्ट्रास्ट्रक्चर के 3 डी पुनर्निर्माण को प्राप्त करना संभव बना दिया है। हालांकि, यह अपरिहार्य है कि ब्लॉक की सतह को यांत्रिक रूप से एसबीएफ-एसईएम के हीरे के चाकू द्वारा या एफआईबी-एसईएम33,37 के केंद्रित आयन बीम के साथ मिलिंग करके काट दिया जाता है। नमूनों के लिए दो विधियों की विनाशकारीता के कारण, आगेके विश्लेषण के लिए उसी लक्ष्य संरचना का पुनर्निर्माण करना संभव नहीं है। इसके अलावा, कुछ अध्ययनों ने रोगसंबंधी परिवर्तनों का निरीक्षण करने के लिए ईएम का उपयोग करके कैंसर कोशिकाओं के 3 डी ऑर्गेनेल अल्ट्रास्ट्रक्चर के पुनर्निर्माण का प्रयास किया है। इन कारणों से, कैंसर कोशिकाओं के पैथोलॉजिकल तंत्र को और स्पष्ट करने के लिए, जैसे कि अग्नाशय ी कैंसर कोशिकाएं, हम क्रिस्टे स्तर पर माइटोकॉन्ड्रियल अल्ट्रास्ट्रक्चर का विश्लेषण करने के लिए एक अल्ट्रामाइक्रोटोम और एक फील्ड उत्सर्जन स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (एफई-एसईएम) का उपयोग करके सीरियल सेक्शन छवियों के 3 डी पुनर्निर्माण के लिए एक नई तकनीक का प्रस्ताव करते हैं; इस तकनीक के साथ, एक कुशल और सुलभ विधि का उपयोग करके उच्च-रिज़ॉल्यूशन डेटा प्राप्त किया जा सकता है। अल्ट्रामाइक्रोटोम का उपयोग करके बनाए गए सीरियल अल्ट्राथिन वर्गों को ग्रिड केस में अर्ध-स्थायी रूप से संग्रहीत किया जा सकता है और कई वर्षों के बाद भी कई बार पुन: चित्रित किया जा सकताहै। एफई-एसईएम को उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग, उच्च आवर्धन और बहुमुखी प्रतिभा प्रदान करने की क्षमता के कारण विभिन्न अनुसंधान क्षेत्रों में एक उपकरण के रूप में अत्यधिक मूल्यवानहै। 3 डी में ऑर्गेनेल की ठीक संरचना को प्रदर्शित करने के प्रयास में, एफई-एसईएम43,44 द्वारा उत्पादित बैक-बिखरे इलेक्ट्रॉनों का उपयोग करके उपयोगी रिज़ॉल्यूशन के साथ सीरियल 2 डी छवि स्टैक बनाने की तकनीक का उपयोगविशेष उपकरणों के बिना लक्ष्य क्षेत्रों या उनके संबंधित संरचनाओं के उच्च-थ्रूपुट और मल्टी-स्केल इमेजिंग को प्राप्त करने के लिए भी किया जा सकता है।. चार्ज कलाकृतियों की पीढ़ी सीधे अधिग्रहित छवियों की गुणवत्ता को प्रभावित करती है, इसलिए निवास समय को कम रखना विशेष रूप से महत्वपूर्ण है।
इस प्रकार, वर्तमान अध्ययन माइटोकॉन्ड्रियल क्रिस्टे46 की 3 डी संरचना के पुनर्निर्माण के लिए इस एसईएम तकनीक में नियोजित प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं पर विस्तार से बताता है। विशेष रूप से, हम माइटोकॉन्ड्रियल क्षेत्रों के अर्ध-स्वचालित विभाजन को प्राप्त करने और अमीरा सॉफ्टवेयर का उपयोग करके 3 डी पुनर्निर्माण को डिजिटाइज़ करने के लिए विकसित प्रक्रिया दिखाते हैं, जिसमें पारंपरिक ओटीओ नमूना तैयारी विधि44,47 का उपयोग करके स्लाइस नमूने बनाना, अल्ट्रामाइक्रोटोम स्लाइसिंग का उपयोग करके अनुभाग संग्रह को पूरा करना और एफई-एसईएम द्वारा अनुक्रमिक 2 डी डेटा प्राप्त करना भी शामिल है।
यहां प्रस्तुत विधि 3 डी पुनर्निर्माण तकनीक को लागू करने के लिए एक उपयोगी चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका है, जिसमें सीरियल अल्ट्राथिन वर्गों से उत्पन्न 2 डी टोमोग्राफिक छवियों के स्टैकिंग और विभाजन के लिए इले?…
The authors have nothing to disclose.
इस शोध को झेजियांग प्रांत अनुदान (Z23H290001, LY19H280001) के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था; चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन अनुदान (82274364, 81673607, और 81774011); साथ ही हुज़ौ विज्ञान और प्रौद्योगिकी अनुदान की लोक कल्याण अनुसंधान परियोजना (2021 GY49, 2018GZ24)। हम मेडिकल रिसर्च सेंटर, एकेडमी ऑफ चाइनीज मेडिकल साइंस, झेजियांग चीनी मेडिकल यूनिवर्सिटी के सार्वजनिक मंच से महान सहायता, तकनीकी सहायता और प्रयोगात्मक समर्थन की सराहना करते हैं।
(1S,3R)-RSL3 | MCE | HY-100218A | |
Acetone | SIGMA | 179124 | |
Amira | Visage Imaging | ||
Aspartic acid | MCE | HY-42068 | |
Dulbecco's modified Eagle’s medium | Gibco | 11995115 | |
Ethanol | Merck | 100983 | |
Ferrostatin-1 | MCE | HY-100579 | |
Fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
Field emission scanning electron microscope | HITACHI | SU8010 | |
Glutaraldehyde | Alfa Aesar | A10500.22 | |
Lead nitrate | SANTA CRUZ | sc-211724 | |
Osmium Tetroxide | SANTA CRUZ | sc-206008B | |
Panc02 | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 98102213 | |
Penicillin-streptomycin | Biosharp | BL505A | |
Phosphate Buffered Saline | Biosharp | BL302A | |
Pon 812 Epoxy resin | SPI CHEM | GS02660 | |
Potassium ferrocyanide | Macklin | P816416 | |
Thiocarbohydrazide | Merck | 223220 | |
Ultramicrotome | LEICA | EMUC7 | |
Uranyl Acetate | RHAWN | R032929 | 2020.2 |