Este protocolo descreve como reconstruir cristas mitocondriais para obter imagens 3D com alta precisão, alta resolução e alto rendimento.
A compreensão das características dinâmicas da ultraestrutura da organela celular, que não é apenas rica em informações desconhecidas, mas também sofisticada de uma perspectiva tridimensional (3D), é fundamental para estudos mecanísticos. A microscopia eletrônica (ME) oferece boa profundidade de imagem e permite a reconstrução de pilhas de imagens de alta resolução para investigar a morfologia ultraestrutural de organelas celulares mesmo na escala nanométrica; portanto, a reconstrução 3D está ganhando importância devido às suas vantagens incomparáveis. A microscopia eletrônica de varredura (MEV) fornece uma tecnologia de aquisição de imagens de alto rendimento que permite reconstruir grandes estruturas em 3D a partir da mesma região de interesse em cortes consecutivos. Portanto, a aplicação da MEV na reconstrução 3D em larga escala para restaurar a verdadeira ultraestrutura 3D de organelas está se tornando cada vez mais comum. Neste protocolo, sugerimos uma combinação de técnicas seriadas de corte ultrafino e reconstrução 3D para estudar cristas mitocondriais em células de câncer de pâncreas. Os detalhes de como essas técnicas são realizadas são descritos neste protocolo de forma passo a passo, incluindo o método ósmio-tiocarboidrazida-ósmio (OTO), a imagem de corte ultrafino seriada e o visor de visualização.
As mitocôndrias são uma das organelas mais importantes da célula. Eles servem como o centro central da bioenergética e metabolismo celular 1,2 e desempenham um papel crítico no câncer3. O câncer de pâncreas (CP) é um dos cânceres mais difíceis de tratar4 devido à sua rápida disseminação e alta taxa de mortalidade. A disfunção mitocondrial, causada principalmente por alterações namorfologia mitocondrial3,5,6,7, tem sido associada aos mecanismos patológicos subjacentes aos CP8. As mitocôndrias também são altamente dinâmicas, o que se reflete nas mudanças frequentes e dinâmicas na conectividade de sua rede e estrutura decristas9. A remodelagem da estrutura das cristas pode afetar diretamente a função mitocondrial e o estadocelular10,11, que são significativamente alterados durante o crescimento das células tumorais, metástases e alterações no microambiente tumoral12,13.
Nos últimos anos, cientistas têm estudado essa organela utilizando a observação de EM14,15,16,17; por exemplo, pesquisadores analisaram a dinâmica mitocondrial utilizando técnicas de reconstrução 3D 6,7,18,19. O conceito geral e o método para a reconstrução 3D de imagens de microscopia eletrônica foram formalmente estabelecidos já em 196820 e envolveram a combinação de microscopia eletrônica, difração de elétrons e processamento de imagens por computador para reconstruir a cauda do fago T4. Até o momento, a tecnologia de imagem 3D por microscopia eletrônica tem feito avanços significativos em termos de resolução de imagem21, grau de automação22 e volume de processamento23 e tem sido usada em escala cada vez mais ampla em pesquisas biológicas, desde o nível tecidual até o nível de ultraestrutura da organela na escala nanométrica24. Nos últimos anos, a microscopia eletrônica 3D também se tornou uma tecnologia promissora para uma ampla gama de aplicações25,26,27.
A crescente atenção às cristas mitocondriais ilustra particularmente os requisitos essenciais para a imagem volumétrica ultraestrutural. A microscopia eletrônica de transmissão (MET) tem sido utilizada para visualizar amostras coletadas em uma grade de cobre (400 mesh)28, com o feixe de elétrons passando pela seção. No entanto, devido ao alcance limitado da grade de cobre, é impossível obter imagens completas de cortes contínuos de uma mesma amostra29. Isso dificulta o estudo das estruturas-alvo durante a aquisição de imagens por TEM. Além disso, a ETM depende de tarefas manuais demoradas e propensas a erros, incluindo corte e coleta de múltiplos cortes e obtenção de imagens sequencialmente21, não sendo adaptada para reconstruções ultraestruturais de amostras de grande volume23. Atualmente, a reconstrução de alta resolução de imagens de amostras de grande volume é obtida por meio do uso de equipamentos especializados, como o TEMCA camera array (TEMCA)30 ou dois sistemas TEMCA de segunda geração (TEMCA2)31, que permitem imagens automatizadas de alto rendimento em um curto espaço de tempo. Entretanto, este tipo de imagem não tem a vantagem de ser de fácil obtenção e universal devido à necessidade de equipamentos personalizados.
Em comparação com o TEM, o método de geração automática de milhares de imagens volumétricas seriais para grandes áreas baseado no SEM 32,33 aumenta a eficiência e a confiabilidade das imagens seriais e oferece resoluções z mais altas34. Por exemplo, a microscopia eletrônica de varredura em bloco serial (SBF-SEM) e a microscopia eletrônica de varredura por feixe de íons focalizado (FIB-SEM) possibilitaram a reconstrução 3D de ultraestrutura com alta velocidade, eficiência e resolução35,36. Entretanto, é inevitável que a superfície do bloco seja raspada mecanicamente pelo bisturi de diamante do MEV-SBF ou pela fresagem com o feixe de íons focalizado do FIB-MEV33,37. Devido à destrutividade dos dois métodos para as amostras, não é possível reconstruir novamente a mesma estrutura alvo para análisesposteriores 38,39,40. Além disso, poucos estudos tentaram reconstruir a ultraestrutura da organela 3D de células cancerosas usando EM para observar alteraçõespatológicas12. Por estas razões, a fim de elucidar melhor os mecanismos patológicos de células cancerosas, como células cancerosas pancreáticas, propomos uma nova tecnologia para a reconstrução 3D de imagens de cortes seriados usando um ultramicrótomo e um microscópio eletrônico de varredura por emissão de campo (MEV-FE) para analisar a ultraestrutura mitocondrial em nível de cristas; Com essa tecnologia, dados de alta resolução podem ser adquiridos por meio de um método eficiente e acessível. As seções ultrafinas seriais feitas usando um ultramicrótomo podem ser armazenadas semi-permanentemente em uma caixa de grade e recriadas várias vezes, mesmo após vários anos41. A MEF-FE é altamente valorizada como ferramenta em vários campos de pesquisa devido à sua capacidade de fornecer imagens de alta resolução, alta magnificação e versatilidade42. Na tentativa de exibir a estrutura fina das organelas em 3D, a técnica para produzir pilhas de imagens 2D seriadas com resolução útil usando elétrons retroespalhados produzidos por FE-SEM 43,44 também pode ser usada para obter imagens de alto rendimento e multiescala de regiões alvo ou suas estruturas associadas sem equipamentos especiais 45. A geração de artefatos de carga afeta diretamente a qualidade das imagens adquiridas, por isso é particularmente importante manter o tempo de permanência curto.
Assim, o presente estudo elabora os procedimentos experimentais empregados nesta técnica de MEV para reconstruir a estrutura 3D das cristas mitocondriais46. Especificamente, mostramos o processo desenvolvido para alcançar a segmentação semiautomática das regiões mitocondriais e digitalizar a reconstrução 3D usando o software Amira, que também envolve a confecção de amostras de corte usando o método convencional de preparação de espécimes OTO44,47, completar a coleta de cortes usando fatiamento de ultramicrótomos e adquirir dados sequenciais 2D por MEV-FE.
O método aqui apresentado é um guia passo-a-passo útil para a aplicação da técnica de reconstrução 3D, que envolve a aplicação de microscopia eletrônica e tecnologia de processamento de imagens para o empilhamento e segmentação de imagens tomográficas 2D geradas a partir de cortes ultrafinos seriados. Este protocolo destaca uma limitação das imagens 2D que pode ser abordada pela visualização 3D da ultraestrutura da organela, que tem como vantagens a forte reprodutibilidade das estruturas em nível de al…
The authors have nothing to disclose.
Esta pesquisa foi apoiada por subsídios da Fundação de Ciências Naturais da Província de Zhejiang (Z23H290001, LY19H280001); Subsídios da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82274364, 81673607 e 81774011); bem como o Projeto de Pesquisa de Bem-Estar Público da Bolsa de Ciência e Tecnologia de Huzhou (2021GY49, 2018GZ24). Agradecemos a grande ajuda, suporte técnico e suporte experimental da Plataforma Pública do Centro de Pesquisa Médica, Academia de Ciências Médicas Chinesas, Universidade Médica Chinesa de Zhejiang.
(1S,3R)-RSL3 | MCE | HY-100218A | |
Acetone | SIGMA | 179124 | |
Amira | Visage Imaging | ||
Aspartic acid | MCE | HY-42068 | |
Dulbecco's modified Eagle’s medium | Gibco | 11995115 | |
Ethanol | Merck | 100983 | |
Ferrostatin-1 | MCE | HY-100579 | |
Fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
Field emission scanning electron microscope | HITACHI | SU8010 | |
Glutaraldehyde | Alfa Aesar | A10500.22 | |
Lead nitrate | SANTA CRUZ | sc-211724 | |
Osmium Tetroxide | SANTA CRUZ | sc-206008B | |
Panc02 | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 98102213 | |
Penicillin-streptomycin | Biosharp | BL505A | |
Phosphate Buffered Saline | Biosharp | BL302A | |
Pon 812 Epoxy resin | SPI CHEM | GS02660 | |
Potassium ferrocyanide | Macklin | P816416 | |
Thiocarbohydrazide | Merck | 223220 | |
Ultramicrotome | LEICA | EMUC7 | |
Uranyl Acetate | RHAWN | R032929 | 2020.2 |