تصف هذه التقنية سير عمل فعال لتصور وقياس إمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات الأكسيد الفائق داخل خلايا هيلا باستخدام التصوير الحي القائم على التألق.
الميتوكوندريا عضيات ديناميكية ضرورية للاتزان الداخلي الأيضي من خلال التحكم في إنتاج الطاقة عن طريق تخليق الأدينوسين الثلاثي الفوسفات (ATP). لدعم التمثيل الغذائي الخلوي ، تتعاون آليات مراقبة جودة الميتوكوندريا المختلفة للحفاظ على شبكة ميتوكوندريا صحية. أحد هذه المسارات هو الميتوفاجي ، حيث يسهل كيناز 1 الناجم عن PTEN (PINK1) و Parkin phospho-ubiquitination للميتوكوندريا التالفة عزل البلعمة الذاتية والإزالة اللاحقة من الخلية عن طريق اندماج الليزوزوم. الميتوفاجي مهم للاتزان الخلوي ، وترتبط الطفرات في باركين بمرض باركنسون (PD). بسبب هذه النتائج ، كان هناك تركيز كبير على التحقيق في تلف الميتوكوندريا ودورانها لفهم الآليات الجزيئية وديناميكيات مراقبة جودة الميتوكوندريا. هنا ، تم استخدام تصوير الخلايا الحية لتصور شبكة الميتوكوندريا لخلايا HeLa ، لتحديد إمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات الأكسيد الفائق بعد العلاج باستخدام سيانيد الكربونيل m-chlorophenyl hydrazone (CCCP) ، وهو عامل فك ارتباط الميتوكوندريا. بالإضافة إلى ذلك ، تم التعبير عن طفرة مرتبطة بمرض باركين (ParkinT240R) والتي تثبط الميتوفاجي المعتمد على باركين لتحديد كيفية تأثير التعبير الطافر على شبكة الميتوكوندريا مقارنة بالخلايا التي تعبر عن باركين من النوع البري. يصف البروتوكول الموضح هنا سير عمل بسيط باستخدام مناهج قائمة على التألق لتحديد إمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات الأكسيد الفائق بشكل فعال.
شبكة الميتوكوندريا عبارة عن سلسلة من العضيات المترابطة التي تلعب دورا حاسما في إنتاج الطاقة1 ، والمناعة الفطرية2,3 ، وإشارات الخلية 4,5. ارتبط عدم تنظيم الميتوكوندريا بالأمراض التنكسية العصبية مثل مرض باركنسون (PD)6,7. PD هو اضطراب تنكسي عصبي تدريجي يؤثر على الخلايا العصبية الدوبامينية للمادة السوداء التي تؤثر على ما يقرب من 10 ملايين شخص في جميع أنحاء العالم8. تم ربط PD وراثيا ب mitophagy ، وهو مسار لمراقبة جودة الميتوكوندريا ضروري للحفاظ على التوازن الخلوي الذي يزيل بشكل انتقائي الميتوكوندرياالتالفة 9,10. حددت الدراسات العديد من مسارات الميتوفاجي المستقلة ، بما في ذلك مجال FUN14 الذي يحتوي على ميتوفاجي بوساطة 1 (FUNDC1) ، وبروتين Bcl-2 المتفاعل 3 (BNIP3) الميسر ، والميتوفاجي المعتمد على NIX ، والكيناز 1 الناجم عن PTEN (PINK1) / الميتوفاجي المنظم بمرض باركين10،11. يعمل PINK1 (كيناز مفترض) وباركين (E3 ubiquitin ligase) جنبا إلى جنب مع الميتوكوندريا التالفة من فوسفو-يوبيكوتينات ، والتي تدفع إلى تكوين البلعمة الذاتية التي تبتلع العضية التالفة وتندمج مع الليزوزومات لبدء التدهور12،13،14،15،16. ارتبطت الطفرات في باركين بالأنماط الظاهرية المرتبطة بمرض باركين مثل التنكس العصبي عن طريق فقدان الخلايا العصبية الدوبامينية17,18.
هنا ، يتم وصف بروتوكول تستخدم فيه خلايا HeLa ، وهي خلايا خلدة تستخدم بشكل روتيني مشتقة من سرطان عنق الرحم ، للتحقيق في دور Parkin في الحفاظ على صحة شبكة الميتوكوندريا. تعبر خلايا هيلا عن مستويات ضئيلة من باركين داخلي المنشأ وبالتالي تتطلب تعبير باركين خارجيالمنشأ 19. لدراسة دور باركين في صحة شبكة الميتوكوندريا ، يتم نقل خلايا هيلا إما باستخدام باركين من النوع البري (ParkinWT) ، أو متحور باركين (ParkinT240R) ، أو ناقل تحكم فارغ. ParkinT240R هو طفرة وراثية جسدية متنحية في مرض باركنسون الأحداث تؤثر على نشاط Parkin E3 ligase ، مما يقلل بشكل كبير من كفاءة مسار الميتوفاجي20. تخضع خلايا هيلا لتركيزات خفيفة (5 ميكرومتر) أو شديدة (20 ميكرومتر) من سيانيد الكربونيل م-كلوروفينيل هيدرازون (CCCP) ، وهو عامل فصل الميتوكوندريا. يستخدم العلاج بتركيزات شديدة من CCCP بشكل روتيني للحث على الميتوفاجي بوساطة باركين في خطوط الخلايا المختلفة ، مثل خلايا HeLa و COS-721،22،23.
بعد العلاج ، يستخدم البروتوكول التصوير الحي لشبكة الميتوكوندريا باستخدام اثنين من الأصباغ الفلورية المستهدفة للميتوكوندريا المتاحة حاليا. رباعي ميثيل رودامين ، إستر الإيثيل ، بيركلورات (TMRE) عبارة عن صبغة كاتيونية تتألق بناء على إمكانات غشاء الميتوكوندريا24 ، في حين أن MitoSOX هو مؤشر فائق أكسيد الميتوكوندريا حيث تكون شدة التألق دالة لتركيز الأكسيد الفائق25. أخيرا ، يستخدم البروتوكول المبين تقديرا كميا قائما على التألق وسير عمل بسيط لتحديد إمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات الأكسيد الفائق بشكل فعال مع الحد الأدنى من نطاق تحيز المستخدم. على الرغم من أن هذا البروتوكول تم تصميمه لدراسة وظيفة الميتوكوندريا في خلايا هيلا ، إلا أنه يمكن تكييفه مع خطوط الخلايا الإضافية وأنواع الخلايا الأولية لتوصيف صحة شبكة الميتوكوندريا كميا.
يمكن استخدام سير العمل الموضح هنا لتحديد إمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات الأكسيد الفائق بقوة وقابلية التكرار باستخدام التصوير القائم على التألق30. هناك قيود فنية مهمة يجب مراعاتها عند تصميم هذه التجارب. تم نقل خلايا هيلا باستخدام ناقل YFP فارغ ، YFP-ParkinWT ، أو YFP-ParkinT2…
The authors have nothing to disclose.
نشكر أعضاء مختبر إيفانز على ملاحظاتهم المدروسة حول هذه المخطوطة. يتم دعم هذا العمل من قبل علماء ديوك وايتهيد ، وعلماء ديوك للعلوم والتكنولوجيا ، وزمالة هانا جراي في معهد هوارد هيوز الطبي (HHMI). تم عمل الشكل 1 أ باستخدام BioRender.com.
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone) | Sigma-Aldrich | C2759 | |
DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose | Gibco | 11-965-084 | |
DMSO, Anhydrous | ThermoFisher Scientific | D12345 | |
Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007103 | |
FuGENE 6 (Tranfection Reagent) | Promega | E2691 | |
GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution) | Gibco | 35-050-061 | |
Hoescht 33342 | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
MitoSOX Red | ThermoFisher Scientific | M36008 | |
MitoTracker Deep Red | ThermoFisher Scientific | M7514 | |
Opti-MEM (Redued Serum media) | ThermoFisher scientific | 31985070 | |
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) | ThermoFisher Scientific | T669 | |
Experimental models: Organisms/Strains | |||
HeLa-M (Homo sapiens) | A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research) | N/A | |
Recombinant DNA | |||
EYFP Empty Vector | N/A | N/A | |
YFP-Parkin T240R | This Paper | Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin | |
YFP-Parkin WT | Addgene; PMID:19029340 | RRID:Addgene_23955 | |
Software and Algorithms | |||
Adobe Illustrator | Adobe Inc. | https://www.adobe.com/products/illustrator | (Schindelin, 2012) |
Excel (Spreadsheet Software) | Microsoft Office | https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel | |
ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
Leica Application Suite (LAS X) | Leica | https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/ | |
Microsoft Excel | Microsoft Office | https://www.microsoft.com/excel | |
Prism9 (Statistical Analysis Software) | GraphPad Software | https://www.graphpad.com | |
Outro | |||
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
Cage Incubator (Environmental Chamber) | Okolab | https://www.oko-lab.com/cage-incubator | |
DMiL Inverted Microscope | Leica | N/A | |
LIGHTNING Deconvolution Software | Leica | N/A | |
STELLARIS 8 confocal microscope | Leica | N/A |