Esta técnica descreve um fluxo de trabalho eficaz para visualizar e medir quantitativamente o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de superóxido dentro de células HeLa usando imagens ao vivo baseadas em fluorescência.
As mitocôndrias são organelas dinâmicas críticas para a homeostase metabólica, controlando a produção de energia via síntese de ATP. Para apoiar o metabolismo celular, vários mecanismos de controle de qualidade mitocondrial cooperam para manter uma rede mitocondrial saudável. Uma dessas vias é a mitofagia, onde a quinase 1 induzida por PTEN (PINK1) e a fosfoubiquitinação de Parkin das mitocôndrias danificadas facilitam o sequestro do autofagossomo e a subsequente remoção da célula via fusão lisossômica. A mitofagia é importante para a homeostase celular, e mutações em Parkin estão ligadas à doença de Parkinson (DP). Devido a esses achados, tem havido uma ênfase significativa na investigação do dano e turnover mitocondrial para entender os mecanismos moleculares e a dinâmica do controle de qualidade mitocondrial. Aqui, imagens de células vivas foram usadas para visualizar a rede mitocondrial de células HeLa, para quantificar o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de superóxido após o tratamento com cianeto de carbonila m-clorofenil hidrazona (CCCP), um agente desacoplador mitocondrial. Além disso, uma mutação PD-ligada de Parkin (ParkinT240R) que inibe a mitofagia Parkin-dependente foi expressa para determinar como a expressão mutante impacta a rede mitocondrial em comparação com as pilhas que expressam Parkin selvagem-tipo. O protocolo descrito aqui descreve um fluxo de trabalho simples usando abordagens baseadas em fluorescência para quantificar o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de superóxido de forma eficaz.
A rede mitocondrial é uma série de organelas interconectadas que desempenham um papel crucial na produção de energia1, imunidade inata 2,3 e sinalização celular 4,5. A desregulação mitocondrial tem sido associada a doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson (DP)6,7. A DP é uma doença neurodegenerativa progressiva que afeta neurônios dopaminérgicos da substância negra e afeta cerca de 10 milhões de pessoas em todo omundo8. A DP tem sido geneticamente ligada à mitofagia, uma via de controle de qualidade mitocondrial necessária para a manutenção da homeostase celular que remove seletivamente as mitocôndrias danificadas 9,10. Estudos identificaram múltiplas vias de mitofagia independentes, incluindo o domínio FUN14 contendo 1 mitofagia mediada por FUNDC1, mitofagia facilitada pela proteína de interação Bcl-2 3 (BNIP3), mitofagia dependente de NIX e a bem caracterizada quinase 1 induzida por PTEN (PINK1)/mitofagia regulada por Parkin10,11. PINK1 (uma suposta quinase) e Parkin (uma ubiquitina ligase E3) trabalham em conjunto com mitocôndrias danificadas por fosfo-ubiquitinato, o que impulsiona a formação de autofagossomos que engolem a organela danificada e se fundem com lisossomos para iniciar a degradação 12,13,14,15,16. Mutações em Parkin têm sido associadas a fenótipos ligados à DP, como a neurodegeneração via perda de neurônios dopaminérgicos17,18.
Aqui, é descrito um protocolo no qual células HeLa, rotineiramente usadas como células imortalizadas derivadas do câncer cervical, são usadas para investigar o papel de Parkin na manutenção da saúde da rede mitocondrial. As células HeLa expressam níveis desprezíveis de Parkin endógeno e, portanto, requerem expressão exógena de Parkin19. Para estudar o papel de Parkin na saúde da rede mitocondrial, as células HeLa são transfectadas com Parkin selvagem (ParkinWT), um mutante Parkin (ParkinT240R) ou um vetor de controle vazio. ParkinT240R é uma mutação autossômica recessiva do parkinsonismo juvenil que afeta a atividade da ligase Parkin E3, reduzindo significativamente a eficiência da via mitofágica20. As células HeLa estão sujeitas a concentrações leves (5 μM) ou severas (20 μM) de cianeto de carbonila m-clorofenil hidrazona (CCCP), um agente desacoplador mitocondrial. O tratamento com concentrações severas de CCCP é rotineiramente utilizado para induzir mitofagia mediada por Parkin em várias linhagens celulares, como células HeLa e COS-721,22,23.
Após o tratamento, o protocolo emprega imagens ao vivo da rede mitocondrial usando dois corantes fluorescentes direcionados para mitocôndrias atualmente disponíveis. A tetrametilrodamina, éster etílico, perclorato (TMRE) é um corante catiônico que fluoresce com base no potencial de membrana mitocondrial24, enquanto a MitoSOX é um indicador de superóxido mitocondrial onde a intensidade da fluorescência é função da concentração de superóxido25. Finalmente, o protocolo delineado usa uma quantificação baseada em fluorescência e fluxo de trabalho simples para quantificar efetivamente o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de superóxido com escopo mínimo para viés do usuário. Embora este protocolo tenha sido desenhado para estudar a função mitocondrial em células HeLa, ele pode ser adaptado para linhagens celulares adicionais e tipos celulares primários para caracterizar quantitativamente a saúde da rede mitocondrial.
O fluxo de trabalho aqui descrito pode ser usado para quantificar o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de superóxido de forma robusta e reprodutível usando imagens baseadas em fluorescência30. Há limitações técnicas importantes a serem consideradas ao projetar esses experimentos. As células HeLa foram transfectadas com um vetor YFP vazio, YFP-ParkinWT ou YFP-ParkinT240R. O vetor YFP vazio foi usado como controle para confirmar que os achados experimentais…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos aos membros do laboratório Evans por seu feedback atencioso sobre este manuscrito. Este trabalho é apoiado por Duke Whitehead Scholars, Duke Science and Technology Scholars, e Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Hanna Gray Fellowship. A Figura 1A foi confeccionada com BioRender.com.
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone) | Sigma-Aldrich | C2759 | |
DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose | Gibco | 11-965-084 | |
DMSO, Anhydrous | ThermoFisher Scientific | D12345 | |
Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007103 | |
FuGENE 6 (Tranfection Reagent) | Promega | E2691 | |
GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution) | Gibco | 35-050-061 | |
Hoescht 33342 | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
MitoSOX Red | ThermoFisher Scientific | M36008 | |
MitoTracker Deep Red | ThermoFisher Scientific | M7514 | |
Opti-MEM (Redued Serum media) | ThermoFisher scientific | 31985070 | |
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) | ThermoFisher Scientific | T669 | |
Experimental models: Organisms/Strains | |||
HeLa-M (Homo sapiens) | A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research) | N/A | |
Recombinant DNA | |||
EYFP Empty Vector | N/A | N/A | |
YFP-Parkin T240R | This Paper | Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin | |
YFP-Parkin WT | Addgene; PMID:19029340 | RRID:Addgene_23955 | |
Software and Algorithms | |||
Adobe Illustrator | Adobe Inc. | https://www.adobe.com/products/illustrator | (Schindelin, 2012) |
Excel (Spreadsheet Software) | Microsoft Office | https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel | |
ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
Leica Application Suite (LAS X) | Leica | https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/ | |
Microsoft Excel | Microsoft Office | https://www.microsoft.com/excel | |
Prism9 (Statistical Analysis Software) | GraphPad Software | https://www.graphpad.com | |
Outro | |||
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
Cage Incubator (Environmental Chamber) | Okolab | https://www.oko-lab.com/cage-incubator | |
DMiL Inverted Microscope | Leica | N/A | |
LIGHTNING Deconvolution Software | Leica | N/A | |
STELLARIS 8 confocal microscope | Leica | N/A |