Этот метод описывает эффективный рабочий процесс для визуализации и количественного измерения потенциала митохондриальной мембраны и уровней супероксида в клетках HeLa с использованием флуоресцентной визуализации в реальном времени.
Митохондрии являются динамическими органеллами, критически важными для метаболического гомеостаза, контролируя выработку энергии посредством синтеза АТФ. Для поддержки клеточного метаболизма различные механизмы контроля качества митохондрий взаимодействуют для поддержания здоровой митохондриальной сети. Одним из таких путей является митофагия, при которой PTEN-индуцированная киназа 1 (PINK1) и фосфо-убиквитинирование Паркина поврежденных митохондрий способствуют секвестрации аутофагосом и последующему удалению из клетки посредством слияния лизосом. Митофагия важна для клеточного гомеостаза, а мутации в Паркине связаны с болезнью Паркинсона (БП). В связи с этими выводами значительное внимание уделялось исследованию повреждений и оборота митохондрий, чтобы понять молекулярные механизмы и динамику контроля качества митохондрий. Здесь визуализация живых клеток использовалась для визуализации митохондриальной сети клеток HeLa, для количественной оценки потенциала митохондриальной мембраны и уровней супероксида после обработки карбонильным цианидом м-хлорфенилгидразоном (CCCP), митохондриальным разъединяющим агентом. Кроме того, была экспрессирована мутация паркина, связанная с болезнью Паркина (ParkinT240R), которая ингибирует паркин-зависимую митофагию, чтобы определить, как экспрессия мутантов влияет на митохондриальную сеть по сравнению с клетками, экспрессирующими паркин дикого типа. Протокол, описанный здесь, описывает простой рабочий процесс с использованием подходов, основанных на флуоресценции, для эффективной количественной оценки потенциала митохондриальной мембраны и уровней супероксида.
Митохондриальная сеть представляет собой ряд взаимосвязанных органелл, которые играют решающую роль в производстве энергии1, врожденном иммунитете2,3 и клеточной сигнализации 4,5. Митохондриальная дисрегуляция была связана с нейродегенеративными заболеваниями, такими как болезнь Паркинсона (БП)6,7. БП — это прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, поражающее дофаминергические нейроны черной субстанции, которое поражает почти 10 миллионов человек во всем мире8. БП генетически связана с митофагией, митохондриальным путем контроля качества, необходимым для поддержания клеточного гомеостаза, который избирательно удаляет поврежденные митохондрии 9,10. Исследования выявили несколько независимых путей митофагии, включая домен FUN14, содержащий 1 (FUNDC1)-опосредованную митофагию, Bcl-2-взаимодействующий белок 3 (BNIP3)-облегченную митофагию, NIX-зависимую митофагию и хорошо охарактеризованную PTEN-индуцированную киназу 1 (PINK1)/паркин-регулируемую митофагию10,11. PINK1 (предполагаемая киназа) и Parkin (убиквитинлигаза E3) работают в тандеме с фосфо-убиквитинатом поврежденных митохондрий, что приводит к образованию аутофагосом, которые поглощают поврежденную органеллу и сливаются с лизосомами, чтобы инициировать деградацию 12,13,14,15,16. Мутации в Паркине были связаны с фенотипами, связанными с болезнью Паркина, такими как нейродегенерация из-за потери дофаминергических нейронов17,18.
Здесь описан протокол, в котором клетки HeLa, обычно используемые иммортализированные клетки, полученные из рака шейки матки, используются для исследования роли паркина в поддержании здоровья митохондриальной сети. Клетки HeLa экспрессируют незначительные уровни эндогенного паркина и, следовательно, требуют экзогенной экспрессии паркина19. Чтобы изучить роль паркина в здоровье митохондриальной сети, клетки HeLa трансфицируют либо паркином дикого типа (ParkinWT), либо мутантом паркина (ParkinT240R), либо пустым контрольным вектором. Parkin T240R представляет собой аутосомно-рецессивную мутацию ювенильного паркинсонизма, которая влияет на активность лигазы Parkin E3, значительно снижая эффективность пути митофагии20. Клетки HeLa подвергаются воздействию мягких (5 мкМ) или тяжелых (20 мкМ) концентраций карбонильного цианида м-хлорфенилгидразона (CCCP), митохондриального развязывающего агента. Лечение тяжелыми концентрациями CCCP обычно используется для индукции митофагии, опосредованной Паркином, в различных клеточных линиях, таких как клетки HeLa и COS-721,22,23.
После лечения протокол использует живую визуализацию митохондриальной сети с использованием двух доступных в настоящее время флуоресцентных красителей, нацеленных на митохондрии. Тетраметилродамин, этиловый эфир, перхлорат (TMRE) представляет собой катионный краситель, который флуоресцирует на основе потенциала митохондриальной мембраны24, в то время как MitoSOX представляет собой митохондриальный супероксидный индикатор, где интенсивность флуоресценции зависит от концентрациисупероксида 25. Наконец, описанный протокол использует количественную оценку на основе флуоресценции и простой рабочий процесс для эффективной количественной оценки потенциала митохондриальной мембраны и уровней супероксида с минимальными возможностями для смещения пользователя. Хотя этот протокол был разработан для изучения функции митохондрий в клетках HeLa, он может быть адаптирован для дополнительных клеточных линий и первичных типов клеток для количественной характеристики здоровья митохондриальной сети.
Рабочий процесс, описанный здесь, может быть использован для количественной оценки потенциала митохондриальной мембраны и уровней супероксида надежно и воспроизводимо с использованием флуоресцентной визуализации30. Существуют важные технические ограничения, которые сл…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим сотрудников лаборатории Эванса за их вдумчивые отзывы об этой рукописи. Эта работа поддерживается стипендиатами Дьюка Уайтхеда, учеными в области науки и техники Дьюка и стипендией Ханны Грей Медицинского института Говарда Хьюза (HHMI). Рисунок 1А был сделан с использованием BioRender.com.
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone) | Sigma-Aldrich | C2759 | |
DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose | Gibco | 11-965-084 | |
DMSO, Anhydrous | ThermoFisher Scientific | D12345 | |
Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007103 | |
FuGENE 6 (Tranfection Reagent) | Promega | E2691 | |
GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution) | Gibco | 35-050-061 | |
Hoescht 33342 | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
MitoSOX Red | ThermoFisher Scientific | M36008 | |
MitoTracker Deep Red | ThermoFisher Scientific | M7514 | |
Opti-MEM (Redued Serum media) | ThermoFisher scientific | 31985070 | |
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) | ThermoFisher Scientific | T669 | |
Experimental models: Organisms/Strains | |||
HeLa-M (Homo sapiens) | A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research) | N/A | |
Recombinant DNA | |||
EYFP Empty Vector | N/A | N/A | |
YFP-Parkin T240R | This Paper | Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin | |
YFP-Parkin WT | Addgene; PMID:19029340 | RRID:Addgene_23955 | |
Software and Algorithms | |||
Adobe Illustrator | Adobe Inc. | https://www.adobe.com/products/illustrator | (Schindelin, 2012) |
Excel (Spreadsheet Software) | Microsoft Office | https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel | |
ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
Leica Application Suite (LAS X) | Leica | https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/ | |
Microsoft Excel | Microsoft Office | https://www.microsoft.com/excel | |
Prism9 (Statistical Analysis Software) | GraphPad Software | https://www.graphpad.com | |
Outro | |||
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
Cage Incubator (Environmental Chamber) | Okolab | https://www.oko-lab.com/cage-incubator | |
DMiL Inverted Microscope | Leica | N/A | |
LIGHTNING Deconvolution Software | Leica | N/A | |
STELLARIS 8 confocal microscope | Leica | N/A |