Her presenterer vi en protokoll for å analysere endringer i mitokondriell tetthet og langsgående fordeling ved hjelp av levende skjelettmuskelavbildning ved hjelp av konfokalmikroskopi for mitokondriell nettverksskanning.
Mitokondrien er en organell som kan forlenges, fragmenteres og renoveres i henhold til cellens metabolske krav. Ombyggingen av mitokondrienettverket gjør det mulig for sunne mitokondrier å møte cellulære krav; Tapet av denne kapasiteten har imidlertid vært relatert til utviklingen eller utviklingen av forskjellige patologier. I skjelettmuskulatur observeres mitokondriell tetthet og distribusjonsendringer i fysiologiske og patologiske forhold som trening, aldring og fedme, blant andre. Derfor kan studiet av mitokondrienettverket gi en bedre forståelse av mekanismer knyttet til disse forholdene.
Her beskrives en protokoll for mitokondrieavbildning av levende skjelettmuskelfibre fra rotter. Fibre dissekeres manuelt i en avslappende løsning og inkuberes med en fluorescerende levende cellebildeindikator for mitokondrier (tetrametylrhodaminetylester, TMRE). Mitokondriesignalet registreres ved konfokalmikroskopi ved hjelp av XYZ-skannemodus for å oppnå konfokale bilder av det intermyofibrillære mitokondrienettverket (IMF). Deretter behandles de konfokale bildene ved terskel og binarisering. Det binariserte konfokale bildet står for de positive pikslene for mitokondrier, som deretter telles for å oppnå mitokondriell tetthet. Det mitokondrielle nettverket i skjelettmuskulaturen er preget av en høy tetthet av IMF-befolkningen, som har en periodisk langsgående fordeling som ligner på T-tubuli (TT). Fast Fourier Transform (FFT) er en standard analyseteknikk utført for å evaluere distribusjonen av TT som gjør det mulig å finne distribusjonsfrekvensen og nivået på organisasjonen. I denne protokollen er implementeringen av FFT-algoritmen beskrevet for analyse av den langsgående mitokondrielle fordelingen i skjelettmuskulatur.
Mitokondrier danner svært dynamiske nettverk som hovedsakelig reguleres av balansen mellom dens forlengelse (fusjon) og fragmentering (fisjon)1,2, som moduleres av ekspresjonen og aktiviteten til proteiner som Mitofusin 1 og 2 (Mfn1 og Mfn2) og optisk proteinatrofi 1 (Opa1), som regulerer fusjonen av den ytre mitokondriemembranen og indre membranen, henholdsvis 1,2. Dynaminrelatert protein (Drp1) regulerer hovedsakelig mitokondriell fisjon når det fosforyleres i Ser6163.
I skjelettmuskulatur er det godt fastslått at mitokondrienettverket er ordnet i strukturelt veldefinerte subpopulasjoner basert på deres nærhet til forskjellige celleregioner (myofibriller, sarcolemma og kjerner)4,5. De mitokondriene som ligger rett under sarcolemma kalles subsarcolemmale mitokondrier (SSM), de som ligger mellom kontraktile filamenter kalles intermyofibrillære mitokondrier (IMF), og mitokondriell subpopulasjon rundt kjernene kalles perinukleære mitokondrienettverk (PMN). Videre har det blitt foreslått at disse mitokondrielle subpopulasjonene har regionspesifikke funksjoner og er metabolsk spesialiserte 4,5.
Opprettholdelsen av cellulær energihomeostase, som tillater metabolsk og kontraktil funksjon, avhenger i stor grad av samspillet og kommunikasjonen på bestemte steder gjennom mitokondrienettverket (f.eks. IMF og SSM-interaksjon)4,6. I tillegg til mitokondrienettverksinteraksjoner kan mitokondrien også interagere med andre organeller, og danne strukturelle og funksjonelle komplekser. I denne forbindelse har det vist seg at IMF kan lokaliseres ved siden av sarkoplasmatisk retikulum (SR) og i nærheten av Ca2+ frigjøringsenhetene (CRU), dannet av tverrrørene (TT) 7. Dette faktum er relevant på grunn av rollen som mitokondrielt Ca2+ opptak i regulering av ATP-syntese og apoptose. Nylig har en potensiell rolle i regulering av cytosoliske Ca2+ transienter også blitt foreslått8.
TT er invaginasjoner av sarcolemma som har en periodisk fordeling langs lengdeaksen til kardiomyocytter og skjelettmuskelfibre 9,10, tilsvarende IMF-distribusjonen 5. Endringer i fordelingen av TT har viktige fysiologiske implikasjoner, gitt deres rolle i kontraktil funksjon. Disse endringene har imidlertid hovedsakelig blitt evaluert i kardiomyocytter. Ved hjelp av Fast Fourier Transform (FFT) analyse tillater konvertering av periodiske signaler fra avstandsdomenet til frekvensdomenet, noe som resulterer i et FFT-spektrum som indikerer frekvensen og regelmessigheten til signalet11,12,13. Selv om det er holdepunkter for at organiseringen av mitokondrienettverket i skjelettmuskelfibre er avgjørende for tilpasning til ulike metabolske tilstander, som ved regenerering etter muskelskade14,15, utføres de fleste analyser kvalitativt.
I tillegg, gitt at mitokondriell dysfunksjon har vært assosiert med flere skjelettmuskelrelaterte (f.eks. misbruksatrofi)2 og ikke-muskelsykdommer, spesielt metabolske sykdommer, og tilhørende tap av muskelmasse (dvs. atrofi)16, har den kvantitative evalueringen av mitokondrienettverket og distribusjonen i skjelettmuskulatur relevans. Nylig, en signifikant forskjell i den langsgående fordeling av mitokondrier av gastrocnemius muskelfibre mellom en overvektig gruppe (Ob; Zucker fa /fa rotter), og en mager gruppe (Lean; Zucker +/+ rotter) ble identifisert gjennom FFT17. Denne studien viste nytten av FFT i å analysere mitokondriefordelingen. Derfor presenterer denne protokollen en metodikk for å studere mitokondrier i levende skjelettmuskelfibre fra bilder oppnådd ved fluorescens konfokalmikroskopi. Mitokondriell tetthet kvantifiseres ved bakgrunnsterskelering, og analysen av langsgående mitokondriell fordeling ved FFT-analyse er også beskrevet. Et arbeidsflytskjema er presentert i figur 1.
Mitokondrier er organeller med høy ombyggingskapasitet. Deres innhold, tetthet og distribusjon kan raskt modifiseres gjennom aktivering av mitokondriell fusjon og fisjonsmekanismer, kjent som mitokondriell dynamikk1, og balansen mellom mitokondrielle omsetningsmekanismer: mitokondriell biogenese og den spesialiserte mitokondrienedbrytningsveien, mitofagi21,22. Mitokondrieinnhold og morfologi kan variere i henhold til celletype og utviklingsstadium og kan remodelleres under forskjellige fysiologiske og patologiske stimuli 17,22,23,24. Derfor har studiet av mitokondriell morfologi vært relevant i over et halvt århundre25. Spesielt har analysen av mitokondrier gjennom elektronmikroskopi vært standardteknikken som ble brukt i flere studier26.
Fluorescerende studier ved konfokalmikroskopi har fått relevans de siste årene på grunn av deres evne til levende celleavbildning av mitokondrier på forskjellige fiberdybder, noe som kan bidra til bedre å forstå mitokondriens rolle i skjelettmuskulatur i forskjellige adaptive og maladaptive forhold27. I denne studien beskrives en metodikk for analyse av mitokondrietetthet og distribusjon i levende skjelettmuskelfibre ved konfokalmikroskopi. En av hovedutfordringene ved å jobbe med levende skjelettmuskelfibre er å unngå sammentrekning fra isolasjonsprosessene opp til mitokondriell konfokal registrering. For å oppnå dette målet brukes en høy Mg og ATP Relax-løsning17 for å holde fibrene avslappet i minst 2 timer, noe som gir nok tid til å utføre fiberisolasjonsprosessen, fluoroforbelastningen og oppkjøpet av mitokondrielt signal ved konfokalmikroskopi. Et kritisk punkt i protokollen er å skaffe fibrene mekanisk siden det krever høy presisjon og ferskt vev; Det er imidlertid mulig å oppnå levedyktige fiberbunter fra rottemuskel med denne tidligere brukte og rapporterte teknikken28. Oppnåelse av intakte fibre gjør det mulig å bevare sarcolemma og det intracellulære miljøet, og holde metabolsk og funksjonell crosstalk mellom cellestrukturer28,29.
I motsetning til å arbeide med vev eller faste celler, tillater oppkjøpet av levende celleavbildningsfluorescerende bilder ved konfokalmikroskopi sanntidsovervåking av effekten av ulike eksperimentelle forhold. Den nåværende protokollen kan brukes til å utforske endringer i mitokondriell tetthet og distribusjon i sanntid og utforske forskjeller mellom eksperimentelle grupper, som eksemplene presentert her mellom magre og Ob-avledede fibre (figur 3 og figur 4). Det bør alltid vurderes at levende celleavbildning innebærer standardisering av optimale arbeidsforhold med mindre celleskader. Arbeidstiden, kvaliteten på løsningene som brukes, innsamlingsparametrene og eksponeringen av lasere må finkontrolleres. Derfor er viktige hensyn nevnt nedenfor.
Mitokondrier av muskelfibre kan ikke registreres helt i lengderetningen ved konfokalmikroskopi på grunn av fiberens størrelse og skade på fiberen som kan skyldes lang lasereksponering. Likevel registreres en representativ prøve av fiberen under denne teknikken. Selv om det er mulig å registrere hele tykkelsen av skjelettmuskelfibrene til en rotte ved konfokalmikroskopi, innebærer dette en lengre opptakstid og eksponering for laserstrålen. Når det gjelder kontrollrotter, har det ikke oppstått problemer med disse opptakene. Imidlertid kan fibre fra patologiske forhold være mer utsatt for skade som observert i fibrene fra Ob-rotter. Følgelig foretrekkes det å anskaffe en stabel med representative konfokale bilder oppnådd på forskjellige Z-avstander. Når bare en del av fibertykkelsen registreres, anbefales det å ta stabelen på samme dybde på alle testede fibre, siden mitokondriell fordeling og tetthet kan variere i henhold til dens posisjon i fiberen. Innsamling av signalet på en dybde over 15 μm anbefales for å få representative konfokale bilder av IMF, og unngå SSM-populasjoner som ligger nær periferien.
Under konfokaloppkjøpet må det tas noen viktige hensyn. Først valget av nedsenkingsobjektivlinsen med tanke på forstørrelse, høy NA og nedsenkingsmedium. Siden celler opprettholdes i et hydrofilt inkubasjonsmedium, må brytningsindeksen for inkubasjons- og nedsenkningsmediet lignes for å oppnå et godt signal og skanne dypt inn i vevet. Oppnås vanligvis ved hjelp av en objektivlinse for nedsenking i vann. Konfokale bilder av figur 3 og figur 4 ble tatt med et 20x, 0.7 NA, vannnedsenkingsmål. Dette målet tillater registrering av fiberen i all sin dybde, men skanning ved 15, 18 og 21 μm ble bestemt siden representative konfokale bilder av IMF kan oppnås med høyt fluorescensintensitetssignal og mindre fiberskade. Annen forstørrelse, for eksempel 40x og olje som nedsenkningsmedium, kan vurderes, men må vurderes.
For det andre beregnes pikselstørrelsen for bildeinnsamling i henhold til Nyquists teorem, som gjør det mulig å velge en passende pikselstørrelse som unngår oversample (høyere lasereksponering) og underprøve (fører til mindre oppløsning)30. Beregningen avhenger av egenskapene til det valgte objektivobjektivet og bølgelengden (~ 90 nm). Den kan justeres med zoomen; Derfor gir bare én zoominnstilling en optimal pikselstørrelse30. Likevel, i praksis, avhenger zoomen også av området av prøven som skal analyseres. Dermed gjør det mulig å finne balanse å jobbe med en pikselstørrelse som er nærmest Nyquist-kriteriet, og som også passer til området som skal analyseres. Figur 3 og figur 4 ble anskaffet med en pikselstørrelse på 150 og 190 nm, noe som tillot analyse av fiberens fulle bredde som er ~ 50-80 μm.
For det tredje bør en passende pinhole diameter som hindrer ut-av-fokus lys fra å nå detektoren brukes. Vanligvis regnes 1 Airy som den optimale pinhole-størrelsen siden den tillater deteksjon av ~ 80% av fotoner som stammer fra fokusplanet30. Likevel krever noen fargede biologiske prøver som viser lave fluorescensnivåer en pinhole økning30. Konfokale bilder av figur 3 og figur 4 ble tatt med en knappenålsstørrelse på 3 Airy på grunn av et lavt signal fanget med en lavere Airy. Det er viktig å vurdere at økningen i signalintensiteten som følge av å øke pinhole-størrelsen fører til reduksjon av oppløsningen på grunn av økt ufokusert fanget lys. Av denne grunn anbefalte vi å bruke en pinhole størrelse så nær 1 luftig som mulig.
Når de er tilstrekkelig anskaffet, kan konfokale bilder behandles for å oppnå kvantitativ informasjon om mitokondriell tetthet og distribusjon. Uansett må det kritiske prosesseringsbildetrinnet med terskelverdi utføres før analyse for å forbedre kvantifiseringen av signalet. Under dette avgjørende trinnet defineres fluorescensintensitetsverdien som skiller de positive pikslene for mitokondrier fra bakgrunnen. Terskelen kan defineres av en gaussisk passform av toppen som representerer mitokondrier når histogrammet til bildet viser to topper, en som svarer til bakgrunnen og den andre til mitokondriene. Det oppnås imidlertid ikke alltid en bimodal fordeling i hvert av bildene, så andre terskelmetoder må brukes.
I denne protokollen beskrives implementeringen av Otsus terskelverdi, som er en ikke-parametrisk og ikke-overvåket metode designet for å finne terskelverdien når de to toppene ikke er atskilt, eller andre topper er til stede31. Otsu kan enkelt brukes ved hjelp av en åpen kildekode-plattform for biologisk bildeanalyse; Imidlertid kan andre terskelmetoder testes. Den samme terskelmetoden må brukes på alle konfokale bilder og må beregnes uavhengig for hvert konfokale bilde. Bruk av terskelen på en hel stabel fører til feil resultater. Når de binære bildene er oppnådd etter terskelprosessen, kan analysen av mitokondriell tetthet og FFT enkelt utføres ved å følge instruksjonene beskrevet i denne protokollen. Imidlertid bør man være forsiktig når man utfører begge analysene for å unngå å inkludere kjerner og kapillærer, da det vil føre til kvantifiseringsfeil. Når det gjelder tetthet, er det nok å trekke pikslene, eller området okkupert av kjernene eller kapillærene, fra pikslene eller det totale arealet som skal analyseres. I tillegg, når du utfører FFT-analysen, må det verifiseres at mitokondriesignalet er rett. Omvendt, når mitokondriesignalet er vippet, kan det produsere profiler som ikke representerer mitokondriell lengdefordeling, noe som gir feil FFT-spektrumdata. I tillegg kan et forbehandlingstrinn brukes for å redusere støyen i bildene. Denne protokollen beskriver to valgfrie forhåndsbehandlingstrinn ved hjelp av et medianfilter og 2D-dekonvolusjon. Effektene av disse forbehandlingsmetodene på bilde- og mitokondrietetthetsinnholdet er presentert i tilleggsfigur S1. Det er viktig å tenke på at selv om disse forprosessene kan forbedre bildekvaliteten, kan de også føre til tap av visse bildedetaljer. Derfor bør de brukes med forsiktighet og konsekvent brukes på alle bildene som analyseres.
Til tross for fordelene er konfokalmikroskopi begrenset av en lateral oppløsning (XY) på 180-250 nm når de optimale betingelsene for oppkjøp er implementert32. Mitokondriell diameter er ~ 200-700 nm, nær diffraksjonsgrensen for konfokal mikroskopi; Submitokondrielle strukturer kan derfor ikke påvises tilstrekkelig33 og kan ikke evalueres ved tetthets- og FFT-analyser vist i denne protokollen. Andre superoppløsningsteknikker for mikroskopi, som stokastisk optisk rekonstruksjonsmikroskopi (STORM), stimulert utslippsuttømming (STED) nanoskopi eller strukturert belysningsmikroskopi (SIM), kan utforskes for å løse submitokondrielle strukturer32. I denne protokollen oppnås de konfokale bildene av mitokondrier ved bruk av fluoroforen TMRE, som avhenger av mitokondriemembranpotensialet. Derfor kan mitokondriell fluorescerende intensitet variere i henhold til deres membranpotensial. En terskelprosess utføres før dataanalysen for å løse dette problemet. Alle pikslene over en definert terskel anses som positive for mitokondriesignal uavhengig av fluorescensverdien. Likevel må det bemerkes at mitokondrier med svært lavt membranpotensial ikke kan løses med denne teknikken. Derfor anbefales komplementære studier av kvantifisering av mitokondrielt proteininnhold. En fordel med å bruke TMRE er at konfokale bilder også kan brukes til mitokondriemembranpotensialanalyse, men tilstrekkelige kontroller med frakoblingsmidler må utføres som karbonylcyanid-p-trifluormetoksyfenylhydrazon (FCCP). I tillegg kan instruksjonene for mitokondriell tetthet og distribusjonsanalyse oppnås ved hjelp av grønne fluorescerende indikatorer for mitokondrier, som laster mitokondrier uavhengig av membranpotensialet, men inkubasjonsstrategi og konfokale oppkjøpsinnstillinger må standardiseres.
Gitt at mitokondriestrukturen er relatert til essensielle mitokondrielle og cellulære funksjoner, kan protokollen beskrevet her gi verdifull informasjon om deres remodellering under sykdom eller ved en bestemt stressfornærmelse. Det kan bidra til en bedre forståelse av nøkkelfunksjoner i skjelettmuskulaturen styrt av mitokondrier, for eksempel energiproduksjon, eller hvor mitokondrier spiller en viktig rolle i samspill med andre organeller, for eksempel sammentrekning-metabolismekobling. Å følge protokollinstruksjonene tillater estimering av mitokondriell tetthet og distribusjon i levende skjelettmuskulatur. Protokolltrinnene er delt inn i tre hovedfaser med fokus på disseksjon av skjelettmuskulaturbunter, konfokalmikroskopiskanning og bildeanalyse, der detaljerte instruksjoner og viktige hensyn er inkludert. Spesielt kan protokollen optimaliseres ytterligere for å utforske flere Z-trinn for full mitokondriell rekonstruksjon i fiberen i henhold til brukerens nødvendigheter. For eksempel kan konfokalbilde- og analysetrinnene testes for å studere cellulære strukturer med lignende fordeling, for eksempel TT i levende og faste prøver.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av School of Medicine og The Institute for Obesity Research of Tecnologico de Monterrey. Figur 3A ble opprettet med programvare for vitenskapelig bilde og illustrasjon.
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A6419 | |
Borosilicate glass coverslip | Warner Instruments | 64-0709 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
Confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
Confocal microscope software Leica Application Suite | Leica | 2.7.3.9723 | |
Creatine Phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | |
DeconvolutionLab2 (DeconvolutionLab_2.jar) | Biomedical Imaging Group, EPFL | http://bigwww.epfl.ch/deconvolution/deconvolutionlab2/ | |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
DL-Aspartic acid potassium sat hemihydrate | Sigma-Aldrich | 11240 | |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N´N´-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | |
Forceps | Miltex | MH-18 | |
HC PL APO 20x/ 0.7 IMM objective | Leica | 506517 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Iris scissors | Miltex | 5-304 | |
L-(-)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
L-glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
Maxchelator | UC Davis Health | https://somapp.ucdmc.ucdavis.edu/pharmacology/bers/maxchelator/downloads.htm | |
Micro scissors | Miltex | 18-1633 | |
Open-source platform for biological-image analysis Fiji | Public, maintained by Eliceiri/LOCI group, Jug group, and Tomancak lab.Fiji | https://fiji.sc/ | |
Phosphocreatine disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
PSF Generator (PSF_Generator.jar) | Biomedical Imaging Group, EPFL | http://bigwww.epfl.ch/algorithms/psfgenerator/ | |
Recording chamber | Warner Instruments | RC-27N | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
Spreadsheet Microsoft Excel | Microsoft | ||
Stereo microscope | Zeiss | Stemi 508 | |
Tetramethylrhodamine, ethyl ester | Invitrogen | T669 |