Här presenterar vi ett protokoll för att analysera förändringar i mitokondriell densitet och longitudinell fördelning genom avbildning av levande skelettmuskulatur med hjälp av konfokalmikroskopi för mitokondriell nätverksskanning.
Mitokondrien är en organell som kan förlängas, fragmenteras och renoveras enligt cellernas metaboliska krav. Ombyggnaden av det mitokondriella nätverket gör det möjligt för friska mitokondrier att möta cellulära krav; Förlusten av denna kapacitet har dock relaterats till utvecklingen eller progressionen av olika patologier. I skelettmuskulaturen observeras mitokondriella densitets- och fördelningsförändringar vid fysiologiska och patologiska tillstånd som träning, åldrande och fetma, bland annat. Därför kan studiet av det mitokondriella nätverket ge en bättre förståelse för mekanismer relaterade till dessa tillstånd.
Här beskrivs ett protokoll för mitokondrieavbildning av levande skelettmuskelfibrer från råttor. Fibrerna dissekeras manuellt i en relaxerande lösning och inkuberas med en fluorescerande levande cellavbildningsindikator för mitokondrier (tetrametylrhodamineylester, TMRE). Mitokondriesignalen registreras med konfokalmikroskopi med hjälp av XYZ-skanningsläget för att få konfokala bilder av det intermyofibrilllära mitokondriella nätverket (IMF). Därefter bearbetas de konfokala bilderna genom trösklar och binarisering. Den binariserade konfokala bilden står för de positiva pixlarna för mitokondrier, som sedan räknas för att erhålla mitokondriedensiteten. Det mitokondriella nätverket i skelettmuskulaturen kännetecknas av en hög täthet av IMF-population, som har en periodisk longitudinell fördelning som liknar den för T-tubuli (TT). Fast Fourier Transform (FFT) är en standardanalysteknik som utförs för att utvärdera fördelningen av TT som gör det möjligt att hitta distributionsfrekvensen och organisationsnivån. I detta protokoll beskrivs implementeringen av FFT-algoritmen för analys av den longitudinella mitokondriella fördelningen i skelettmuskulaturen.
Mitokondrier bildar mycket dynamiska nätverk som huvudsakligen regleras av balansen mellan dess förlängning (fusion) och fragmentering (fission)1,2, som moduleras av uttrycket och aktiviteten hos proteiner såsom mitofusin 1 och 2 (Mfn1 och Mfn2) och optisk proteinatrofi 1 (Opa1), som reglerar fusionen av det yttre mitokondriella membranet och det inre membranet, respektive 1,2. Dynaminrelaterat protein (Drp1) reglerar främst mitokondriell fission när det fosforyleras i Ser6163.
I skelettmuskulaturen är det väl etablerat att det mitokondriella nätverket är ordnat i strukturellt väldefinierade subpopulationer baserat på deras närhet till olika cellregioner (myofibriller, sarkolemma och kärnor)4,5. De mitokondrier som ligger precis under sarkolemma kallas subsarkolemmala mitokondrier (SSM), de som ligger mellan de kontraktila filamenten kallas intermyofibrillära mitokondrier (IMF), och den mitokondriella subpopulationen runt kärnorna kallas perinukleära mitokondrier nätverk (PMN). Dessutom har det föreslagits att dessa mitokondriella subpopulationer har regionspecifika funktioner och är metaboliskt specialiserade 4,5.
Upprätthållandet av cellulär energihomeostas, som möjliggör metabolisk och kontraktil funktion, beror till stor del på interaktion och kommunikation på specifika platser genom det mitokondriella nätverket (t.ex. IMF- och SSM-interaktion)4,6. Förutom mitokondriernas nätverksinteraktioner kan mitokondrien också interagera med andra organeller och bilda strukturella och funktionella komplex. I detta avseende har det visats att IMF kan placeras intill det sarkoplasmatiska nätverket (SR) och i närheten av Ca2+ frisättningsenheterna (CRU), som bildas av de tvärgående tubuli (TT)7. Detta faktum är relevant på grund av den roll som mitokondriellt Ca2+-upptag spelar för att reglera ATP-syntes och apoptos. Nyligen har en potentiell roll i regleringen av cytosoliska Ca2+-transienter också föreslagits8.
TT är invaginationer av sarkolemma som har en periodisk fördelning längs den längsgående axeln av kardiomyocyter och skelettmuskelfibrer 9,10, liknande IMF-fördelningen 5. Förändringar i fördelningen av TT har viktiga fysiologiska implikationer, med tanke på deras roll i kontraktil funktion. Dessa förändringar har dock främst utvärderats i kardiomyocyter. Genom att använda FFT-analys (Fast Fourier Transform) kan periodiska signaler omvandlas från avståndsdomänen till frekvensdomänen, vilket resulterar i ett FFT-spektrum som indikerar frekvensen och regelbundenheten för signalen11,12,13. Även om det finns bevis för att organisationen av det mitokondriella nätverket i skelettmuskelfibrer är avgörande för anpassning till olika metabola tillstånd, som under regenerering efter muskelskada14,15, utförs de flesta analyser kvalitativt.
Dessutom, med tanke på att mitokondriell dysfunktion har associerats med flera skelettmuskelrelaterade (t.ex. disuse atrofi)2 och icke-muskelsjukdomar, särskilt metabola sjukdomar, och den associerade förlusten av muskelmassa (dvs. atrofi)16, är den kvantitativa utvärderingen av det mitokondriella nätverket och fördelningen i skelettmuskulaturen relevant. Nyligen har en signifikant skillnad i den longitudinella fördelningen av mitokondrier av gastrocnemius muskelfibrer mellan en överviktig grupp (Ob; Zucker fa/fa rats) och en mager grupp (Lean; Zucker +/+ råttor) identifierades genom FFT17. Denna studie visade användbarheten av FFT för att analysera mitokondriefördelningen. Därför presenterar detta protokoll en metod för att studera mitokondrier i levande skelettmuskelfibrer från bilder erhållna genom fluorescenskonfokalmikroskopi. Mitokondriell densitet kvantifieras genom bakgrundströskelvärde, och analysen av longitudinell mitokondriell fördelning genom FFT-analys beskrivs också. Ett arbetsflödesschema visas i figur 1.
Mitokondrier är organeller med hög ombyggnadskapacitet. Deras innehåll, densitet och fördelning kan snabbt modifieras genom aktivering av mitokondriernas fusions- och fissionsmekanismer, känd som mitokondriell dynamik1, och balansen mellan de mitokondriella omsättningsmekanismerna: den mitokondriella biogenesen och den specialiserade mitokondriernas nedbrytningsväg, mitofagi21,22. Mitokondriellt innehåll och morfologi kan variera beroende på celltyp och utvecklingsstadium och kan omformas under olika fysiologiska och patologiska stimuli 17,22,23,24. Därför har studiet av mitokondriell morfologi varit relevant i över ett halvt sekel25. Noterbart är att analys av mitokondrier genom elektronmikroskopi har varit standardtekniken som tillämpats i flera studier26.
Fluorescerande studier med konfokalmikroskopi har fått relevans under de senaste åren på grund av deras kapacitet för avbildning av mitokondrier i levande celler på olika fiberdjup, vilket kan bidra till att bättre förstå mitokondriernas roll i skelettmuskulaturen vid olika adaptiva och maladaptiva förhållanden27. I denna studie beskrivs en metodik för analys av mitokondriernas täthet och fördelning i levande skelettmuskelfibrer med konfokalmikroskopi. En av de största utmaningarna med att arbeta med levande skelettmuskelfibrer är att undvika sammandragning från isoleringsprocesserna upp till den mitokondriella konfokala inspelningen. För att uppnå detta mål används en hög Mg- och ATP Relax-lösning17 för att hålla fibrerna avslappnade i minst 2 timmar, vilket ger tillräckligt med tid för att utföra fiberisoleringsprocessen, fluoroforbelastningen och insamlingen av mitokondriell signal genom konfokalmikroskopi. En kritisk punkt i protokollet är att erhålla fibrerna mekaniskt eftersom det kräver hög precision och färsk vävnad; Det är dock möjligt att erhålla livskraftiga fiberknippen från råttmuskler med denna tidigare använda och rapporterade teknik28. Att erhålla intakta fibrer gör det möjligt att bevara sarkolemma och den intracellulära miljön, vilket håller den metaboliska och funktionella överhörningen mellan cellstrukturer28,29.
Till skillnad från att arbeta med vävnader eller fasta celler, möjliggör insamling av fluorescerande bilder av levande celler genom konfokalmikroskopi realtidsövervakning av effekten av olika experimentella förhållanden. Det aktuella protokollet kan användas för att utforska förändringar i mitokondriell densitet och distribution i realtid och utforska skillnader mellan experimentella grupper, såsom de exempel som presenteras här mellan Lean- och Ob-härledda fibrer (Figur 3 och Figur 4). Det bör alltid beaktas att avbildning av levande celler innebär att man standardiserar optimala arbetsförhållanden med mindre cellskador. Arbetstiden, kvaliteten på de lösningar som används, insamlingsparametrarna och exponeringen av lasrar måste kontrolleras noggrant. Därför nämns viktiga överväganden nedan.
Mitokondrier i muskelfibrer kan inte registreras helt longitudinellt med konfokalmikroskopi på grund av fiberns storlek och den skada på fibern som kan orsakas av lång laserexponering. Icke desto mindre registreras ett representativt prov av fibern under denna teknik. Även om det är möjligt att registrera hela tjockleken på skelettmuskelfibern hos en råtta med konfokalmikroskopi, innebär detta en längre inspelningstid och exponering för laserstrålen. När det gäller kontrollråttor har inga problem med dessa inspelningar påträffats. Fibrer från patologiska tillstånd kan dock vara mer mottagliga för skador som observerats i fibrerna från Ob-råttor. Därför är det att föredra att skaffa en stapel med representativa konfokala bilder som tagits på olika Z-avstånd. När endast en sektion av fibertjockleken registreras, rekommenderas det att ta stacken på samma djup på alla testade fibrer eftersom mitokondriell fördelning och densitet kan variera beroende på dess position i fibern. Insamling av signalen på ett djup över 15 μm rekommenderas för att få representativa konfokalbilder av IMF och undvika SSM-populationer som ligger nära periferin.
Under konfokalförvärvet måste några viktiga överväganden beaktas. För det första, valet av nedsänkningsobjektivet med tanke på förstoringen, höga NA och nedsänkningsmediet. Eftersom cellerna hålls kvar i ett hydrofilt inkubationsmedium måste brytningsindexet för inkubations- och nedsänkningsmediet vara likartat för att få en bra signal och skanna djupt in i vävnaden. Uppnås vanligtvis med hjälp av en objektivlins med vattennedsänkning. Konfokala bilder av figur 3 och figur 4 togs med ett 20x, 0,7 NA, vattennedsänkningsmål. Detta objektiv gör det möjligt att registrera fibern i hela dess djup, men skanning vid 15, 18 och 21 μm bestämdes eftersom representativa konfokala bilder av IMF kan erhållas med signal med hög fluorescensintensitet och mindre fiberskador. Annan förstoring, såsom 40x och olja som nedsänkningsmedium, kan övervägas men behöver utvärderas.
För det andra beräknas pixelstorleken för bildtagning enligt Nyquists sats, vilket gör det möjligt att välja en lämplig pixelstorlek som undviker översampling (högre laserexponering) och undersampling (leder till mindre upplösning)30. Beräkningen beror på egenskaperna hos den valda objektivlinsen och våglängden (~90 nm). Den kan justeras med zoomen; Därför ger endast en zoominställning en optimal pixelstorlek30. Men i praktiken beror zoomen också på området på provet som ska analyseras. Att hitta balans gör det alltså möjligt att arbeta med en pixelstorlek som ligger närmast Nyquist-kriteriet och som också passar det område som ska analyseras. Figur 3 och figur 4 förvärvades med en pixelstorlek på 150 och 190 nm, vilket möjliggjorde analys av fiberns fulla bredd som är ~50-80 μm.
För det tredje bör en lämplig håldiameter som förhindrar oskarpt ljus från att nå detektorn användas. Vanligtvis anses 1 Airy vara den optimala nålhålsstorleken eftersom den tillåter detektion av ~80 % av fotonerna som kommer från fokusplanet30. Icke desto mindre kräver vissa färgade biologiska prover som visar låga fluorescensnivåer en nålhålsökning30. Konfokala bilder av figur 3 och figur 4 togs med en nålhålsstorlek på 3 Airy på grund av en låg signal som fångades med en lägre Airy. Det är viktigt att tänka på att ökningen av signalintensiteten till följd av en ökning av nålhålsstorleken leder till en minskning av upplösningen på grund av ökat oskarpt fångat ljus. Av denna anledning rekommenderar vi att du använder en nålhålsstorlek så nära 1 luftig som möjligt.
När de är tillräckligt insamlade kan konfokala bilder bearbetas för att få kvantitativ information om mitokondriell densitet och distribution. Oavsett vilket måste det kritiska bearbetningsbildsteget för tröskelvärde utföras före analys för att förbättra kvantifieringen av signalen. Under detta avgörande steg definieras fluorescensintensitetsvärdet som separerar de positiva pixlarna för mitokondrier från de i bakgrunden. Tröskelvärdet kan definieras av en gaussisk anpassning av toppen som representerar mitokondrier när bildens histogram visar två toppar, en som motsvarar bakgrunden och den andra mitokondrierna. En bimodal fördelning uppnås dock inte alltid i var och en av bilderna, så andra tröskelmetoder måste tillämpas.
I detta protokoll beskrivs implementeringen av Otsus tröskelvärde, som är en icke-parametrisk och oövervakad metod som är utformad för att hitta tröskelvärdet när de två topparna inte är separerade eller när andra toppar är närvarande31. Otsu kan enkelt appliceras med hjälp av en plattform med öppen källkod för biologisk bildanalys; Andra tröskelmetoder kan dock testas. Samma tröskelmetod måste tillämpas på alla konfokala bilder och måste beräknas separat för varje konfokal bild. Om du tillämpar tröskelvärdet på en hel stack leder det till felaktiga resultat. När de binära bilderna har erhållits efter tröskelprocessen kan analysen av mitokondriell densitet och FFT enkelt utföras genom att följa instruktionerna som beskrivs i detta protokoll. Försiktighet bör dock iakttas när man utför båda analyserna för att undvika att inkludera kärnor och kapillärer, eftersom det skulle leda till kvantifieringsfel. När det gäller densitet räcker det att subtrahera pixlarna, eller området som upptas av kärnorna eller kapillärerna, från pixlarna eller den totala arean som ska analyseras. Dessutom, när man utför FFT-analysen, måste det verifieras att mitokondriesignalen är rak. Omvänt, när mitokondriesignalen lutas, kan den producera profiler som inte representerar mitokondriernas longitudinella fördelning, vilket ger felaktiga FFT-spektrumdata. Dessutom kan ett förbehandlingssteg tillämpas för att minska bruset i bilderna. Det här protokollet beskriver två valfria förbearbetningssteg med hjälp av ett medianfilter och 2D-faltning. Effekterna av dessa förbehandlingsmetoder på bilden och mitokondriedensiteten presenteras i tilläggsfigur S1. Det är viktigt att tänka på att även om dessa förprocesser kan förbättra bildkvaliteten, kan de också leda till att vissa bilddetaljer går förlorade. Därför bör de användas med försiktighet och konsekvent tillämpas på alla bilder som analyseras.
Trots sina fördelar begränsas konfokalmikroskopi av en lateral upplösning (XY) på 180-250 nm när de optimala förutsättningarna för insamling är implementerade32. Mitokondriell diameter är ~200-700 nm, nära diffraktionsgränsen för konfokalmikroskopi; Således kan submitokondriella strukturer inte detekteras på ett adekvat sätt33 och kan inte utvärderas genom densitets- och FFT-analyser som visas i detta protokoll. Andra superupplösningstekniker för mikroskopi, såsom stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (STORM), nanoskopi med stimulerad emissionsutarmning (STED) eller strukturerad belysningsmikroskopi (SIM), kan utforskas för att lösa upp submitokondriella strukturer32. I detta protokoll erhålls de konfokala bilderna av mitokondrier med hjälp av fluoroforen TMRE, som beror på mitokondriemembranpotentialen. Därför kan mitokondriell fluorescerande intensitet variera beroende på deras membranpotential. En tröskelprocess utförs före dataanalysen för att lösa det här problemet. Alla pixlar över ett definierat tröskelvärde anses vara positiva för mitokondriell signal oberoende av deras fluorescensvärde. Det måste dock noteras att mitokondrier med mycket låg membranpotential inte kan lösas med denna teknik. Kompletterande studier av kvantifiering av mitokondriellt proteininnehåll rekommenderas därför. En fördel med att använda TMRE är att konfokala bilder också kan användas för analys av mitokondriemembranpotential, men adekvata kontroller med frånkopplingsmedel måste utföras såsom karbonylcyanid-p-trifluormetoxifenylhydrazon (FCCP). Dessutom kan instruktionerna för mitokondriell densitets- och distributionsanalys uppnås med hjälp av gröna fluorescerande indikatorer för mitokondrier, som belastar mitokondrier oavsett deras membranpotential, men inkubationsstrategi och konfokala insamlingsinställningar måste standardiseras.
Med tanke på att mitokondriernas struktur är relaterad till viktiga mitokondriella och cellulära funktioner, kan protokollet som beskrivs här ge värdefull information om deras ombyggnad under sjukdom eller genom en särskild stressförolämpning. Det kan bidra till en bättre förståelse av nyckelfunktioner i skelettmuskulaturen som styrs av mitokondrier, såsom energiproduktion, eller där mitokondrier spelar en viktig roll i interaktionen med andra organeller, såsom kontraktion-metabolismkoppling. Att följa protokollinstruktionerna gör det möjligt att uppskatta mitokondriell densitet och fördelning i levande skelettmuskulatur. Protokollstegen är indelade i tre huvudsteg med fokus på dissektion av skelettmuskulaturen, konfokalmikroskopi och bildanalys, där detaljerade instruktioner och viktiga överväganden ingår. Noterbart är att protokollet kan optimeras ytterligare för att utforska ytterligare Z-steg för fullständig mitokondriell rekonstruktion i fibern enligt användarens behov. Till exempel kan de konfokala bild- och analysstegen testas för att studera cellulära strukturer med liknande fördelning, såsom TT i levande och fasta prover.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av School of Medicine och Institute for Obesity Research vid Tecnologico de Monterrey. Figur 3A skapades med hjälp av programvaran Scientific Image and Illustration.
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A6419 | |
Borosilicate glass coverslip | Warner Instruments | 64-0709 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
Confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
Confocal microscope software Leica Application Suite | Leica | 2.7.3.9723 | |
Creatine Phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | |
DeconvolutionLab2 (DeconvolutionLab_2.jar) | Biomedical Imaging Group, EPFL | http://bigwww.epfl.ch/deconvolution/deconvolutionlab2/ | |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
DL-Aspartic acid potassium sat hemihydrate | Sigma-Aldrich | 11240 | |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N´N´-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | |
Forceps | Miltex | MH-18 | |
HC PL APO 20x/ 0.7 IMM objective | Leica | 506517 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Iris scissors | Miltex | 5-304 | |
L-(-)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
L-glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
Maxchelator | UC Davis Health | https://somapp.ucdmc.ucdavis.edu/pharmacology/bers/maxchelator/downloads.htm | |
Micro scissors | Miltex | 18-1633 | |
Open-source platform for biological-image analysis Fiji | Public, maintained by Eliceiri/LOCI group, Jug group, and Tomancak lab.Fiji | https://fiji.sc/ | |
Phosphocreatine disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
PSF Generator (PSF_Generator.jar) | Biomedical Imaging Group, EPFL | http://bigwww.epfl.ch/algorithms/psfgenerator/ | |
Recording chamber | Warner Instruments | RC-27N | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
Spreadsheet Microsoft Excel | Microsoft | ||
Stereo microscope | Zeiss | Stemi 508 | |
Tetramethylrhodamine, ethyl ester | Invitrogen | T669 |