Die "Brain Milking"-Methode zur Isolierung von neuralen Stammzellen und Oligodendrozyten-Vorläuferzellen aus lebenden Ratten
Summary
Eine Methode zur Isolierung von neuralen Stammzellen und Oligodendrozyten-Vorläuferzellen aus dem Gehirn lebender Ratten wird hier experimentell detailliert vorgestellt. Es ermöglicht die mehrfache Entnahme dieser Zellen von denselben Tieren, ohne ihr Wohlbefinden zu beeinträchtigen.
Abstract
Gewebespezifische neurale Stammzellen (NSCs) bleiben im postnatalen Gehirn von Säugetieren aktiv. Sie befinden sich in spezialisierten Nischen, wo sie neue Neuronen und Gliazellen erzeugen. Eine solche Nische ist die subependymale Zone (SEZ; auch ventrikulär-subventrikuläre Zone genannt), die sich quer über die lateralen Wände der lateralen Ventrikel neben der ependymalen Zellschicht befindet. Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) sind reichlich im zentralen Nervensystem verteilt und bilden einen Pool proliferativer Vorläuferzellen, die Oligodendrozyten erzeugen können.
Sowohl NSCs als auch OPCs weisen ein Selbsterneuerungspotenzial und Ruhe-/Aktivierungszyklen auf. Aufgrund ihrer Lage erfolgt die Isolierung und experimentelle Untersuchung dieser Zellen postmortal. Hier beschreiben wir ausführlich das “Brain Milking”, eine Methode zur Isolierung von NSCs und OPCs, unter anderem von Zellen, aus lebenden Tieren. Dabei handelt es sich um ein zweistufiges Protokoll, das für den Einsatz bei Nagetieren entwickelt und an Ratten getestet wurde. Zunächst werden die Zellen durch stereotaktische intrazerebroventrikuläre (i.c.v.) Injektion eines “Freisetzungscocktails” aus dem Gewebe “freigesetzt”. Die Hauptbestandteile sind die Neuraminidase, die auf Ependymzellen abzielt und die Denudation der Ventrikelwand induziert, ein Integrin-β1-blockierender Antikörper und der Fibroblasten-Wachstumsfaktor-2. In einem zweiten Schritt der “Entnahme” werden Flüssigbiopsien von Liquor cerebrospinalis aus der Cisterna magna durchgeführt, bei anästhesierten Ratten, ohne dass ein Schnitt erforderlich ist.
Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass isolierte Zellen ihr endogenes Profil beibehalten und dass NSCs der Sonderwirtschaftszone ihre Ruhe bewahren. Die Denudation der Ependymschicht ist auf die anatomische Ebene der Injektion beschränkt und das Protokoll (Freisetzung und Entnahme) wird von den Tieren gut vertragen. Dieser neuartige Ansatz ebnet den Weg für die Durchführung von Längsschnittstudien zur endogenen Neurogenese und Gliogenese bei Versuchstieren.
Introduction
Gewebespezifische Stammzellen sind teilweise gebundene Zellen, aus denen alle Zellpopulationen hervorgehen können, aus denen die jeweiligen Gewebe bestehen. Abgesehen davon, dass sie multipotent sind, sind sie selbsterneuernde Zellen und entscheidend für die Aufrechterhaltung der Homöostase und der Regenerationsfähigkeit von Geweben1. Einige gewebespezifische Stammzellen verbleiben in einem aktiven, stark proliferativen Zustand, wie z. B. intestinale oder hämatopoetische Stammzellen. Andere, wie z. B. Hirnstammzellen, bleiben weitgehend ruhend oder ruhend2. Im erwachsenen Gehirn befinden sich neurale Stammzellen (NSCs) in spezialisierten Bereichen, die oft als Nischen bezeichnet werden. Zwei solcher gut beschriebenen Bereiche existieren in der subependymalen Zone (SEZ) der Seitenventrikel und im Gyrus dentatus des Hippocampus. Die SWZ-Nische erzeugt die höchste Anzahl von Zellen, vor allem Neuroblasten, die in Richtung der Riechkolben wandern und zur lokalen Interneuronenpopulation beitragen; Im Gegensatz dazu wandern generierte Oligodendroblasten in das benachbarte Corpus callosum (CC)3. Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) sind mitotisch aktive Zellen, die weit über das zentrale Nervensystem verteilt sind und die: i) an die oligodendrogliale Linie gebunden sind, ii) zu Demyelinisierungsstellen wandern können und iii) sich zu myelinisierenden Oligodendrozyten differenzieren können. OPCs weisen auch ein Selbsterneuerungspotenzial und eine Ruhephaseauf 4.
Bisher erforderte die Isolierung und Untersuchung von NSCs und OPCs eine postmortale Dissoziation des präparierten Hirn- und Rückenmarksgewebes. Um diese experimentelle Einschränkung zu umgehen, haben wir eine Methode entwickelt, die es zum ersten Mal ermöglicht, NSCs und OPCs im Gehirn aus lebenden Tieren zu isolieren. Wir nennen diese Methode “Melken”, weil sie mehrere Ansammlungen von Zellen ermöglicht, da ihre Pools nicht erschöpft sind. Das Protokoll wurde aufgrund ihrer großen Gehirngröße an Ratten entwickelt und zielt hauptsächlich auf die SEZ oder das CC ab und umfasst zwei Hauptschritte. Zunächst werden NSCs oder OPCs durch i.c.v.-Injektion eines “Freisetzungscocktails” aus dem Gewebe “entfernt”, der Neuraminidase, ein Toxin, das die Ventrikelwanddenudation induziert, einen Integrin-β1-blockierenden Antikörper und den Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) enthält. Der Cocktail wird stereopädisch beidseitig in die Seitenventrikel injiziert. Wenn die beabsichtigte Verwendung die Isolierung von NSCs ist, werden rostrale Bereiche der lateralen Ventrikel anvisiert. Geht es darum, OPCs reiner zu isolieren, wird der Cocktail kaudal in den Bereich der hippocampalen Fimbrien injiziert. In einem zweiten Schritt der “Entnahme” werden Flüssigbiopsien von Liquor cerebrospinalis (CSF) aus der Cisterna magna von anästhesierten Ratten durchgeführt, ohne dass ein Schnitt erforderlich ist. Die Flüssigbiopsie wird mit NSC-Nährmedium gemischt und kann bis zum Anrichten bei 4 °C aufbewahrt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stamm- und Vorläuferzellen sind im Hirngewebe von Säugetieren relativ spärlich. Darüber hinaus befinden sich NSCs in Bereichen, die für einfache und sichere Biopsien unzugänglich sind (Ventrikelwände, Hippocampus). Daher war die einzige Möglichkeit, mit solchen Zellen experimentell zu arbeiten, bisher ihre postmortale Isolierung. Eine Methode, die die einmalige oder wiederholte Entnahme von NSCs und OPCs von lebenden Ratten ermöglicht, das sogenannte Melken, wird hier Schritt für Schritt beschrieben. Die Method…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium von Action Medical Research (UK) (GN2291) an R.J.M.F. und I.K. Die Forschungsarbeiten wurden auch teilweise von der Hellenic Foundation for Research and Innovation (H.F.R.I.) im Rahmen des “First Call for H.F.R.I. Research Projects to support Faculty members and Researchers and the procurement of high-cost research equipment grant” (Projektnummer: 3395) unterstützt (Tierkosten und Unterstützung für D.D.).
Materials
| Release cocktail | |||
| β1-integrin-blocking antibody | BD Biosciences | #555002 | purified NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Any abntibody with blocking activity should be appropriate. |
| Neuraminidase from Clostridium perfringens (Clostridium welchii) | Sigma-Aldrich | #N2876 | Neuraminidases fromother sources (e.g., from Vibrio cholerae) have not been tested. |
| Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | #100-18B | kept as a 1 μg/μL stock, diluted in sterile water at -20 °C |
| Surgical procedures | |||
| 10 µL Syringe | Hamilton | #80330 | Model 701 RN, Small Removable Needle, 26s gauge, 2 in., point style 2 |
| BD Micro-fine 1 mL insulin syringes | BD biosciences | 04085-00 | 29 G x 12.7 mm |
| BETADINE CUT.SOL 10% FLx30ML | LAVIPHARM-CASTALIA | SKU: 5201048131168 | |
| Bupaq | RICHTERPHARMA | 1021854AF | 10 mL (buprenophine 0.3 mg/mL) |
| Digital New Standard Stereotaxic, Rat and Mouse | Stoelting | 51500D | |
| Homeothermic Monitoring System | Harvard Apparatus | 55-7020 | |
| ISOFLURIN 1,000 mg/g inhalation vapour, liquid | Vetpharma Animal Health | 32509/4031 | |
| Ketamidor | RICHTER PHARMA | SKU: 9004114002531 | Ketamine 100 mg/mL |
| Nylon suture, Ethilon | Ethicon | D9635 | Clear , size 5-0 |
| Rechargeable Cordless Surgical Trimmers | Stoelting | Item:51472 | |
| Scalpel blades, sterile | Swann Morton | AW050 | |
| Scopettes Jr. 8-inch Swabs | Birchwood Laboratories | 34-7021-12P | |
| Stereotaxic High Speed Drill | Foredom | 1474w/o1464 | |
| Stoelting’s Stereotaxic Instrument Kit | Stoelting | Item: 52189 | |
| Xylan 2% | Chanelle Pharmaceuticals | 13764/03/19-5-2004 | Xylazine, 25 mL |
| Tissue and cells handling and immunostainings | |||
| 96-well plates appropriate for microscopy | Greiner | #655866 | Screen star microplate |
| B27 supplement | ThermoFisher Scientific | A1486701 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Merck | P06-1391100 | Fraction V, heat shock |
| Citrate | Merck | 71497 | Sodium citrate monobasic |
| Cryostat | Leica | CM1510S | |
| DAPI | Merck, Calbiochem | 28718-90-3 | Nuclear staining, Dilution: 1/1,000 |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11995065 | High glucose, pyruvate |
| donkey anti-goat | Biotium | 20016 or 20106 or 20048 | Dilution: 1/1,000 |
| donkey anti-mouse | Biotium | 20014 or 20105 or 20046 | Dilution: 1/1,000 |
| donkey anti-rabbit | Biotium | 20015 or 20098 or 20047 | Dilution: 1/1,000 |
| EGF | Peprotech | 315-09 | |
| FGF-2 (or bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| goat anti-GFAP | Abcam | ab53554 | Dilution: 1/500 |
| goat anti-SOX2 | Santa Cruz Biotecnology | sc-17320 | Dilution: 1/200 |
| mouse anti-ID3 | Santa Cruz Biotecnology | sc-56712 | Dilution: 1/200 |
| mouse anti-S100β | Sigma | S2532 | Dilution: 1/200 |
| Mowiol | Merck, Calbiochem | 475904 | Mounting medium |
| N2 supplement | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| Parafolmadehyde | Merck | 158127 | |
| Poly-D-Lysine | Merck, Millipore | A-003-E | Solution, 1.0 mg/mL |
| rabbit anti-Doublecortin (DCX) | Abcam | ab18723 | Dilution: 1/500 |
| rabbit anti-PDGFRα | Abcam | ab51875 | Dilution: 1/200 |
| rabbit anti-β- catenin | Abcam | ab16051 | Dilution: 1/500 |
| Triton X-100 | Merck | X100 | |
| Microscopy and image analysis | |||
| Confocal microscope | Leica | SP6 and SP8 | |
| Image analysis | NIH, USA | ImageJ | |
| Image analysis | Leica | LasX |
Referências
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