Functionele site-directed fluorometrie in inheemse cellen om de prikkelbaarheid van skeletspieren te bestuderen
Summary
Functionele site-directed fluorometrie is een methode om eiwitdomeinbewegingen in realtime te bestuderen. Modificatie van deze techniek voor de toepassing ervan in native cellen maakt nu de detectie en tracking mogelijk van bewegingen van enkele spanningssensor van spanningsafhankelijke Ca2 + -kanalen in murine geïsoleerde skeletspiervezels.
Abstract
Functionele site-directed fluorometrie is de techniek bij uitstek geweest om de structuur-functie relatie van talrijke membraaneiwitten te onderzoeken, inclusief spanningsafhankelijke ionkanalen. Deze benadering is voornamelijk gebruikt in heterologe expressiesystemen om tegelijkertijd membraanstromen, de elektrische manifestatie van de activiteit van de kanalen en fluorescentiemetingen te meten, waarbij lokale domeinherschikkingen worden gerapporteerd. Functionele site-directed fluorometrie combineert elektrofysiologie, moleculaire biologie, chemie en fluorescentie in een enkele brede techniek die de studie van real-time structurele herschikkingen en functie door middel van respectievelijk fluorescentie en elektrofysiologie mogelijk maakt. Meestal vereist deze aanpak een ontworpen spanningsomheind membraankanaal dat een cysteïne bevat die kan worden getest door een thiol-reactieve fluorescerende kleurstof. Tot voor kort werd de thiol-reactieve chemie die werd gebruikt voor de plaatsgerichte fluorescerende etikettering van eiwitten uitsluitend uitgevoerd in Xenopus-eicellen en cellijnen, waardoor de reikwijdte van de benadering tot primaire niet-prikkelbare cellen werd beperkt. Dit rapport beschrijft de toepasbaarheid van functionele site-directed fluorometrie in volwassen skeletspiercellen om de vroege stappen van excitatie-contractiekoppeling te bestuderen, het proces waarbij elektrische depolarisatie van spiervezels wordt gekoppeld aan de activering van spiercontractie. Het huidige protocol beschrijft de methodologieën voor het ontwerpen en transfecteren van cysteïne-engineered voltage-gated Ca2 + -kanalen (CaV1.1) in spiervezels van de flexor digitorum brevis van volwassen muizen met behulp van in vivo elektroporatie en de daaropvolgende stappen die nodig zijn voor functionele site-directed fluorometriemetingen. Deze aanpak kan worden aangepast om andere ionkanalen en eiwitten te bestuderen. Het gebruik van functionele plaatsgerichte fluorometrie van zoogdierspieren is met name relevant voor het bestuderen van basismechanismen van prikkelbaarheid.
Introduction
Het vermogen om conformatieherschikkingen van ionkanalen te volgen als reactie op een bekende elektrische stimulus in een levende cel is een bron van waardevolle informatie voor de moleculaire fysiologie1. Voltage-gated ionkanalen zijn membraaneiwitten die veranderingen in transmembraanspanning waarnemen, en hun functie wordt ook beïnvloed door spanningsveranderingen2. De ontwikkeling van spanningsklemtechnieken in de vorige eeuw stelde fysiologen in staat om in real-time ionische stromen te bestuderen die door spanningsafhankelijke ionkanalen werden gedragen als reactie op membraandepolarisatie3. Het gebruik van spanningsklemtechnologie is cruciaal geweest bij het begrijpen van de elektrische eigenschappen van prikkelbare cellen zoals neuronen en spieren. In de jaren 1970 maakte de verfijning van de spanningsklem de detectie mogelijk van gatingstromen (of laadbeweging) in spanningsafhankelijke calcium- (Ca V) en natriumkanalen(NaV) 4,5. Gatingstromen zijn niet-lineaire capacitieve stromen die ontstaan door de beweging van spanningssensoren als reactie op veranderingen in het elektrische veld over het celmembraan6. Gating-stromen worden beschouwd als een elektrische manifestatie van moleculaire herschikkingen die voorafgaan aan of gepaard gaan met ionkanaalopening7. Hoewel deze stroommetingen waardevolle informatie opleveren over de functie van het kanaal, zijn zowel ionische stromen als gatingstromen indirecte uitlezingen van inter- en intramoleculaire conformatieherschikkingen van spanningsafhankelijke kanalen7.
Functionele site-directed fluorometrie (FSDF; ook wel spanningsklemfluorometrie, VCF) werd ontwikkeld in de vroege jaren 19908 en bood voor het eerst de mogelijkheid om lokale conformatieveranderingen en de functie van een kanaaleiwit in realtime direct te bekijken. Met behulp van een combinatie van kanaalmutagenese, elektrofysiologie en heterologe expressiesystemen is het mogelijk om de bewegende delen van specifieke kanalen of receptoren fluorescerend te taggen en te volgen als reactie op de activerende stimulus 9,10. Deze benadering is uitgebreid gebruikt om de spanningsdetectiemechanismen in spanningsafhankelijke ionkanalen 8,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 te bestuderen. Voor gezaghebbende beoordelingen, zie 10,20,21,22,23.
De Ca V- en NaV-kanalen, die cruciaal zijn voor het initiëren en voortplanten van elektrische signalen, bestaan uit een hoofd-α1-subeenheid, die een centrale porie en vier niet-identieke spanningsdetectiedomeinen2 bezit. Naast hun verschillende primaire structuur worden Ca V- en NaV-kanalen uitgedrukt als multisubunitcomplexen met hulpsubeenheden24. Spanningsafhankelijke kaliumkanalen (K V) bestaan uit vier subeenheden die eruit zien als een enkel domein van Na V of CaV25. De porievormende en spanningsgevoelige α1-subeenheid van Ca V- en NaV-kanalen wordt gevormd door een enkele polypeptide die codeert voor vier afzonderlijke domeinen van zes unieke transmembraansegmenten (S1-S6; Figuur 1A) 24,26. Het gebied bestaande uit S1 tot S4 transmembraansegmenten vormen het spanningsdetectiedomein (VSD) en S5- en S6-transmembraansegmenten vormen het poriedomein26. In elke VSD bevat de S4 α-helix positief geladen arginine of lysine (figuur 1A, B) die bewegen als reactie op membraandepolarisatie7. Enkele decennia van onderzoek en de resultaten van zeer diverse experimentele benaderingen ondersteunen het uitgangspunt dat S4-segmenten naar buiten bewegen en gatingstromen genereren, als reactie op membraandepolarisatie6.
FSDF meet de fluorescentieveranderingen van een thiol-reactieve kleurstof geconjugeerd aan een specifiek cysteïneresidu (d.w.z. de S4 α-helix) op een ionkanaal of ander eiwit, gemanipuleerd via plaatsgerichte mutagenese, omdat het kanaal functioneert als reactie op membraandepolarisatie of andere stimuli10. In feite is FSDF oorspronkelijk ontwikkeld om te onderzoeken of het S4-segment in KV-kanalen, voorgesteld als de hoofdspanningssensor van het kanaal, beweegt wanneer de gatingladingen bewegen als reactie op veranderingen in membraanpotentiaal 8,10. In het geval van voltage-gated ionkanalen kan FSDF onafhankelijke conformatieherschikkingen van de vier VSD’s oplossen (waarbij één VSD op een bepaald moment wordt gevolgd), gelijktijdig met kanaalfunctiemetingen. Met behulp van deze benadering is inderdaad aangetoond dat individuele VSD’s differentieel betrokken lijken te zijn bij specifieke aspecten van kanaalactivering en -inactivatie 12,27,28,29,30. Het identificeren van de bijdrage van elke VSD aan de functie van de kanalen is van groot belang en kan worden gebruikt om de werking van het kanaal verder te verduidelijken en mogelijk nieuwe doelen voor de ontwikkeling van geneesmiddelen te identificeren.
Het gebruik van FSDF in heterologe expressiesystemen is zeer nuttig geweest bij het bevorderen van ons begrip van kanaalfunctie vanuit een reductionistisch perspectief10,23. Zoals veel reductionistische benaderingen biedt het voordelen, maar heeft het ook beperkingen. Een belangrijke beperking is bijvoorbeeld de gedeeltelijke reconstitutie van de kanaalnano-omgeving in het heterologe systeem. Vaak interageren ionkanalen met tal van accessoire subeenheden en tal van andere eiwitten die hun functie wijzigen31. In principe kunnen verschillende kanalen en hun accessoire subeenheden worden uitgedrukt in heterologe systemen met behulp van meerdere eiwitcoderende constructen of polycistronische plasmiden, maar hun oorspronkelijke omgeving kan niet volledig worden gereconstitueerd30,32.
Onze groep publiceerde onlangs een variant van FSDF in inheemse gedissocieerde skeletspiervezels voor de studie van vroege stappen van excitatie-contractiekoppeling (ECC)33,34, het proces waarbij elektrische depolarisatie van spiervezels wordt gekoppeld aan de activering van spiercontractie 35,36. Voor het eerst maakte deze aanpak het mogelijk om individuele S4-spanningssensoren te volgen van het spanningsafhankelijke L-type Ca2 + -kanaal (CaV1.1, ook bekend als DHPR) in de oorspronkelijke omgeving van een volwassen gedifferentieerde spiervezel37. Dit werd bereikt door rekening te houden met meerdere kenmerken van dit celtype, waaronder de elektrische activiteit van de cel die snelle stimulatie-geïnduceerde zelfgepropageerde depolarisatie mogelijk maakt, het vermogen om cDNA-plasmide tot expressie te brengen door middel van in vivo elektroporatie, de natuurlijke hoge expressie en compartimentale organisatie van de kanalen in de cel, en de compatibiliteit met snelle beeldvorming en elektrofysiologische opnameapparaten. Voorheen gebruikten we een confocale microscoop met hoge snelheid als detectieapparaat37. Nu wordt een variant van de techniek gepresenteerd met behulp van een fotodiode voor signaalacquisitie. Dit op fotodiode gebaseerde detectiesysteem zou de implementatie van deze techniek in andere laboratoria kunnen vergemakkelijken.
Hier wordt een stapsgewijs protocol beschreven om FSDF in native cellen te gebruiken voor de studie van individuele spanningssensorbewegingen van CaV1.1. Hoewel het CaV1.1-kanaal in dit manuscript als voorbeeld is gebruikt, kan deze techniek worden toegepast op extracellulair toegankelijke domeinen van andere ionkanalen, receptoren of oppervlakte-eiwitten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier wordt een stapsgewijs protocol beschreven om FSDF in spiervezels uit te voeren voor de studie van individuele spanningssensorbewegingen van het CaV1.1-kanaal. Hoewel het aantal stappen en de diversiteit aan benaderingen die in deze techniek worden gecombineerd complex lijken, worden de meeste van deze technieken vaak routinematig gebruikt in laboratoria van biofysici / celbiologen. De schijnbare complexiteit ligt dus vooral in de combinatie van alle verschillende benaderingen in één geïntegreerde techn…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Dr. J. Vergara (University of California, Los Angeles) voor het delen van het EGFP-CaV1.1 (konijn) wild-type plasmide. We danken het Yale Department of Physiology Electronics Laboratory en in het bijzonder Henrik Abildgaard voor het ontwerp en de bouw van de fotodiode met track and hold circuit. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health subsidies R01-AR075726 en R01-NS103777
Materials
| Hyaluronidase | SIGMA ALDRICH | H3884-50mg | |
| 0.5 mL Eppendorf tube | Millipore Sigma | EP022363719-500EA | |
| 1 mL syringe | Millipore Sigma | Z683531-100EA | tuberculine slip tip |
| 1/2” long 29-gauge sterile insulin needle and syringe | Becton Dikinson | 324702 | |
| 35 mm non coated plastic plate | Falcon, Corning | 353001 | |
| 60 mm non coated plastic plate | Falcon, Corning | 351007 | |
| Alcoholic whip | PDI | B60307 | |
| Alexa-533 cube LP | Chroma | 49907 | Ex: 530/30x; BS: 532; Em: 550lp |
| Arc lamp | Sutter Instrumets | LB-LS 672 | |
| Artificial tears cream | Akorn | NDC 59399-162-35 | |
| Borosilicate glass Pasteur pipet 5 3/4" | VWR | 14672-200 | |
| BTS (N-benzyl-p-toluene sulphonamide) | SIGMA ALDRICH | 203895 | |
| collagenase type I | SIGMA ALDRICH | C0130-1g | |
| Cotton tip | VWR | VWR-76048-960-BG | |
| Double electrode array (for electroporation) | BTX harvard apparatus | 45-0120 | 10mm 2 needle array tips |
| EGFP cube | Chroma | 39002AT | Ex: 480/30x; BS 505; Em: 535/40m |
| Electroporation apparatus device | BTX harvard apparatus | ECM 830 | |
| EPC10 | HEKA Elektronik GmbH (Harvard Bioscience) | 895000 | |
| FBS | Biotechne, R&D Systems | RND-S11150H | Fetal Bovine Serum – Premium, Heat Inactivated |
| glass coverslip 35 mm dish | MatTek Life Science | P35G-1.5-14-C | |
| Isoflurane | Fluriso (Isoflurane) Liquid for Inhalation | 502017-250ml | |
| Isothermal heating pad | Braintree scientific inc | 39DP | |
| Laminin | Thermo Fisher | INV-23017015 | Laminin Mouse Protein, Natural |
| Latex bulb | VWR | 82024-554 | |
| LED 530 nm | Sutter Instrumets | 5A-530 | |
| Low binding protein 0.2 μm sterile filter | Pall | FG4579 | acrodisk syringe filter 0.2um supor membrane low protein binding non pyrogenic |
| MEM | Invitrogen | INV-11380037 | |
| MTS-5-TAMRA | Biotium | 89410-784 | MTS-5-TAMRA |
| OriginPro Analysis Software | OriginLab Corporation | OriginPro 2022 (64-bit) SR1 | |
| Photodiode | Custom Made | NA | |
| PlanApo 60x oil 1.4 N.A/∞/0.17 | Olympus | BFPC2 | |
| Platinum wire 0.5 mm, 99.9 % metals basis | SIGMA | 267228-1G | To manufacyte field stimulation electrode |
| Pulse Generator | WPI | Pulsemaster A300 | |
| Shutter drive controller | Uniblitz | 100-2B | |
| Shuttter | Uniblitz | VS2582T0-100 | |
| S-MEM | Invitrogen | INV-11380037 | |
| Sterile bench pad | VWR | DSI-B1623 | |
| Sterile saline | SIGMA ALDRICH | S8776 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer kit | Dow Corning | 1419447-1198 | |
| Vaporizer for Anesthesia | Parkland Scientific | V3000PK | |
| Voltage generator | Custom Made | NA |
Referências
- Catterall, W. A., Wisedchaisri, G., Zheng, N. The chemical basis for electrical signaling. Nature Chemical Biology. 13 (5), 455-463 (2017).
- Armstrong, C. M., Hille, B. Voltage-gated ion channels and electrical excitability. Neuron. 20 (3), 371-380 (1998).
- Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
- Armstrong, C. M., Bezanilla, F. Currents related to movement of the gating particles of the sodium channels. Nature. 242 (5398), 459-461 (1973).
- Schneider, M. F., Chandler, W. K. Voltage dependent charge movement of skeletal muscle: a possible step in excitation-contraction coupling. Nature. 242 (5395), 244-246 (1973).
- Bezanilla, F. Gating currents. The Journal of General Physiology. 150 (7), 911-932 (2018).
- Bezanilla, F. The voltage sensor in voltage-dependent ion channels. Physiological Reviews. 80 (2), 555-592 (2000).
- Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating. Science. 271 (5246), 213-216 (1996).
- Akabas, M. H. Cysteine modification: probing channel structure, function and conformational change. Advances in Experimental Medicine and Biology. 869, 25-54 (2015).
- Priest, M., Bezanilla, F. Functional site-directed fluorometry. Advances in Experimental Medicine and Biology. 869, 55-76 (2015).
- Cha, A., Bezanilla, F. Characterizing voltage-dependent conformational changes in the Shaker K+ channel with fluorescence. Neuron. 19 (5), 1127-1140 (1997).
- Pantazis, A., Savalli, N., Sigg, D., Neely, A., Olcese, R. Functional heterogeneity of the four voltage sensors of a human L-type calcium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (51), 18381-18386 (2014).
- Savalli, N., Kondratiev, A., Toro, L., Olcese, R. Voltage-dependent conformational changes in human Ca(2+)- and voltage-activated K(+) channel, revealed by voltage-clamp fluorometry. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (33), 12619-12624 (2006).
- Zheng, J., Zagotta, W. N. Gating rearrangements in cyclic nucleotide-gated channels revealed by patch-clamp fluorometry. Neuron. 28 (2), 369-374 (2000).
- Bannister, J. P. A., Chanda, B., Bezanilla, F., Papazian, D. M. Optical detection of rate-determining ion-modulated conformational changes of the ether-à-go-go K+ channel voltage sensor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (51), 18718-18723 (2005).
- Bruening-Wright, A., Elinder, F., Larsson, H. P. Kinetic relationship between the voltage sensor and the activation gate in spHCN channels. The Journal of General Physiology. 130 (1), 71-81 (2007).
- Osteen, J. D., et al. KCNE1 alters the voltage sensor movements necessary to open the KCNQ1 channel gate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (52), 22710-22715 (2010).
- Smith, P. L., Yellen, G. Fast and slow voltage sensor movements in HERG potassium channels. The Journal of General Physiology. 119 (3), 275-293 (2002).
- Gonzalez, C., Koch, H. P., Drum, B. M., Larsson, H. P. Strong cooperativity between subunits in voltage-gated proton channels. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (1), 51-56 (2010).
- Gandhi, C. S., Olcese, R. The voltage-clamp fluorometry technique. Methods in Molecular Biology. 491, 213-231 (2008).
- Horne, A. J., Fedida, D. Use of voltage clamp fluorimetry in understanding potassium channel gating: a review of Shaker fluorescence data. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 87 (6), 411-418 (2009).
- Zhu, W., Varga, Z., Silva, J. R. Molecular motions that shape the cardiac action potential: Insights from voltage clamp fluorometry. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 120 (1-3), 3-17 (2016).
- Cowgill, J., Chanda, B. The contribution of voltage clamp fluorometry to the understanding of channel and transporter mechanisms. The Journal of General Physiology. 151 (10), 1163-1172 (2019).
- Catterall, W. A., Lenaeus, M. J., Gamal El-Din, T. M. Structure and pharmacology of voltage-gated sodium and calcium channels. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 60, 133-154 (2020).
- MacKinnon, R. Determination of the subunit stoichiometry of a voltage-activated potassium channel. Nature. 350 (6315), 232-235 (1991).
- Wu, J., et al. Structure of the voltage-gated calcium channel Ca(v)1.1 at 3.6 Å resolution. Nature. 537 (7619), 191-196 (2016).
- Capes, D. L., Goldschen-Ohm, M. P., Arcisio-Miranda, M., Bezanilla, F., Chanda, B. Domain IV voltage-sensor movement is both sufficient and rate limiting for fast inactivation in sodium channels. The Journal of General Physiology. 142 (2), 101-112 (2013).
- Cha, A., Ruben, P. C., George, A. L., Fujimoto, E., Bezanilla, F. Voltage sensors in domains III and IV, but not I and II, are immobilized by Na+ channel fast inactivation. Neuron. 22 (1), 73-87 (1999).
- Muroi, Y., Arcisio-Miranda, M., Chowdhury, S., Chanda, B. Molecular determinants of coupling between the domain III voltage sensor and pore of a sodium channel. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (2), 230-237 (2010).
- Savalli, N., et al. The distinct role of the four voltage sensors of the skeletal CaV1.1 channel in voltage-dependent activation. The Journal of General Physiology. 153 (11), e202112915 (2021).
- Muller, C. S., et al. Quantitative proteomics of the Cav2 channel nano-environments in the mammalian brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (34), 14950-14957 (2010).
- Perni, S., Lavorato, M., Beam, K. G. De novo reconstitution reveals the proteins required for skeletal muscle voltage-induced Ca2+ release. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (52), 13822-13827 (2017).
- Beam, K. G., Horowicz, P. . Excitation-Contraction Coupling in Skeletal Muscle. , (2004).
- Schneider, M. F., Hernandez-Ochoa, E. O. . Muscle: Fundamental Biology and Mechanisms of Disease. , 811-822 (2012).
- Rios, E., Pizarro, G. Voltage sensor of excitation-contraction coupling in skeletal muscle. Physiological Reviews. 71 (3), 849-908 (1991).
- Hernandez-Ochoa, E. O., Schneider, M. F. Voltage sensing mechanism in skeletal muscle excitation-contraction coupling: coming of age or midlife crisis. Skeletal Muscle. 8 (1), 22 (2018).
- Banks, Q., et al. Voltage sensor movements of CaV1.1 during an action potential in skeletal muscle fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (40), e2026116118 (2021).
- DiFranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (32), e1520 (2009).
- Blunck, R., Starace, D. M., Correa, A. M., Bezanilla, F. Detecting rearrangements of shaker and NaChBac in real-time with fluorescence spectroscopy in patch-clamped mammalian cells. Biophysical Journal. 86 (6), 3966-3980 (2004).
- Liu, Y., Carroll, S. L., Klein, M. G., Schneider, M. F. Calcium transients and calcium homeostasis in adult mouse fast-twitch skeletal muscle fibers in culture. The American Journal of Physiology. 272 (6), C1919-C1927 (1997).
- Hernandez-Ochoa, E. O., Vanegas, C., Iyer, S. R., Lovering, R. M., Schneider, M. F. Alternating bipolar field stimulation identifies muscle fibers with defective excitability but maintained local Ca(2+) signals and contraction. Skeletal Muscle. 6, 6 (2016).
- Klein, M. G., Simon, B. J., Szucs, G., Schneider, M. F. Simultaneous recording of calcium transients in skeletal muscle using high- and low-affinity calcium indicators. Biophysical Journal. 53 (6), 971-988 (1988).
- Irving, M., Maylie, J., Sizto, N. L., Chandler, W. K. Intrinsic optical and passive electrical properties of cut frog twitch fibers. The Journal of General Physiology. 89 (1), 1-40 (1987).
- Hernandez-Ochoa, E. O., Schneider, M. F. Voltage clamp methods for the study of membrane currents and SR Ca(2+) release in adult skeletal muscle fibres. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 108 (3), 98-118 (2012).
- Banks, Q., et al. Optical recording of action potential initiation and propagation in mouse skeletal muscle fibers. Biophysical Journal. 115 (11), 2127-2140 (2018).
- Bannister, R. A. Bridging the myoplasmic gap II: more recent advances in skeletal muscle excitation-contraction coupling. The Journal of Experimental Biology. 219, 175-182 (2016).
- Bannister, R. A., Beam, K. G. Ca(V)1.1: The atypical prototypical voltage-gated Ca2+ channel. Biochimica et Biophysica Acta. 1828 (7), 1587-1597 (2013).
- Beard, N. A., Wei, L., Dulhunty, A. F. Ca(2+) signaling in striated muscle: the elusive roles of triadin, junctin, and calsequestrin. European Biophysics Journal. 39 (1), 27-36 (2009).
- Polster, A., Perni, S., Bichraoui, H., Beam, K. G. Stac adaptor proteins regulate trafficking and function of muscle and neuronal L-type Ca2+ channels. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (2), 602-606 (2015).
- Perni, S. The builders of the junction: roles of Junctophilin1 and Junctophilin2 in the assembly of the sarcoplasmic reticulum-plasma membrane junctions in striated muscle. Biomolecules. 12 (1), 109 (2022).
