Beoordeling van bladluis effect van entomopathogene schimmels tegen parthenogenetisch insect, mosterdluis, Lipaphis erysimi (Kalt.)
Summary
Dit protocol presenteert een geoptimaliseerd vrijstaand bioassaysysteem voor het evalueren van de effectiviteit van entomopathogene schimmels (EPF) tegen de mosterdluis (Lipaphis erysimi (Kalt.)), een parthenogenetisch insect. De methode schetst het gegevensverzamelingsproces tijdens experimenten met petrischaaltjes, waardoor onderzoekers consequent de virulentie van EPF kunnen meten tegen mosterdbladluizen en andere parthenogenetische insecten.
Abstract
De mosterdluis (L. erysimi) is een plaag die verschillende kruisbloemige gewassen aantast en plantenvirussen overbrengt. Om milieuvriendelijke plaagbestrijding te bereiken, zijn entomopathogene schimmels (EPF) potentiële microbiële bestrijdingsmiddelen voor het bestrijden van deze plaag. Daarom is virulentiescreening van EPF-isolaten onder petrischaalcondities noodzakelijk vóór toepassing in het veld. De mosterdluis is echter een parthenogenetisch insect, waardoor het moeilijk is om gegevens vast te leggen tijdens experimenten met petrischaaltjes. Om dit probleem aan te pakken, werd een aangepast systeem voor bioassays met losse bladeren ontwikkeld, waarbij een microsproeier werd gebruikt om conidia op bladluizen te inoculeren en verdrinking te voorkomen door het drogen aan de lucht na sporensuspensie te vergemakkelijken. Het systeem handhaafde gedurende de hele observatieperiode een hoge relatieve vochtigheid en de bladschijf bleef meer dan tien dagen vers, waardoor parthenogenetische reproductie van de bladluizen mogelijk was. Om de opbouw van nakomelingen te voorkomen, werd een proces van dagelijkse verwijdering met behulp van een verfborstel geïmplementeerd. Dit protocol demonstreert een stabiel systeem voor het evalueren van de virulentie van EPF-isolaten tegen mosterdluis of andere bladluizen, waardoor de selectie van potentiële isolaten voor bladluisbestrijding mogelijk wordt.
Introduction
De mosterdluis (L. erysimi) is een beruchte plaag die een verscheidenheid aan kruisbloemige gewassen aantast en aanzienlijke economische verliezen veroorzaakt. Hoewel verschillende systematische insecticiden zijn aanbevolen om bladluisplagen te bestrijden, geeft het frequente gebruik van deze insecticiden aanleiding tot bezorgdheid over resistentie tegen pesticiden 2,3. Daarom zouden entomopathogene schimmels (EPF) in termen van milieuvriendelijke plaagbestrijding kunnen dienen als een geschikte alternatieve bestrijdingsstrategie. EPF is een ziekteverwekker van insecten met het vermogen om gastheren te infecteren door hun nagelriemen binnen te dringen, waardoor het een krachtig middel is voor het bestrijden van bladluizen en andere plantenzuigende insecten4. Bovendien heeft EPF bewezen een haalbare en duurzame plaagbestrijdingstechniek te zijn, die voordelen biedt zoals antagonisme van plantpathogenen en bevordering van de plantengroei5.
EPF kan worden verkregen door middel van aas in de grond van insecten of geïsoleerd uit insectenkadavers in het veld 6,7. Alvorens verder gebruik van schimmelisolaten is echter screening op pathogeniteit noodzakelijk. Er zijn verschillende onderzoeken uitgevoerd naar de effectiviteit van EPF tegen bladluizen, dit zijn belangrijke gewasplagen die ernstige schade kunnen aanrichten 8,9. Mosterdbladluizen, naast verschillende soorten bladluizen, zijn getest op gevoeligheid voor verschillende stammen van Beauveria spp., Metarhizium spp., Lecanicillium spp., Paecilomyces spp. en zelfs Alternaria, dat vooral bekend staat als een saprofytische en plantpathogene schimmel, maar enkele dodelijke effecten heeft vertoond tegen mosterdbladluizen10,11,12.
Om de effectiviteit van EPF tegen bladluizen onder laboratoriumomstandigheden te evalueren, kunnen bioassays worden onderverdeeld in twee hoofddelen: de inoculatiekamer en schimmelinoculatie. Het huidige protocol beschrijft de bouw van een inoculatiekamer, waar bladluizen op verschillende manieren kunnen worden onderhouden, zoals een uitgesneden blad met een bladsteel gewikkeld in vochtig katoen, een uitgesneden bladschijf met een petrischaal bekleed met vochtig filtreerpapier, direct onderhoud aan potplanten, of een uitgesneden bladschijf ingebed in wateragar in een petrischaal of -container10, 11,13. Veelgebruikte methoden voor schimmelinoculatie zijn onder meer conidia sproeien, bladluisonderdompeling in een conidia-suspensie, bladonderdompeling in een conidia-suspensie en endofyteninoculatie van planten11,14,15,16. Hoewel er verschillende inoculatiemethoden bestaan, moeten de bioassays de toepassingsomstandigheden in het veld simuleren. In het geval van de bladgedompelde methode12,17 kan bijvoorbeeld de efficiëntie van EPF worden geëvalueerd, maar aangezien de bladluizen de met schimmel beladen bladeren besmetten, wordt de dorsale zijde van de bladluis, die een preferentiële penetratieplaats is, meestal niet blootgesteld aan de schimmel.
Om het bladluiseffect van EPF onder laboratoriumomstandigheden te evalueren, stelt dit protocol voor om de losbladmethode te gebruiken die is beschreven door Yokomi en Gottwald18 met enkele aanpassingen, gevolgd door conidia-inoculatie met behulp van een microsproeier. Deze methode handhaaft de luchtvochtigheid in de bioassaykamer gedurende ten minste zeven dagen met ongeveer 100% zonder dat er extra water hoeft te worden bijgevuld18,19. Bovendien zorgt het beperken van bladluizen tot één oppervlak ervoor dat ze worden blootgesteld aan conidia-sproeien en vergemakkelijkt het observaties20. Bladluizen kunnen echter vast komen te zitten in het blootgestelde agaroppervlak terwijl ze zich binnen de inoculatiekamer bewegen. Bovendien kan het opnemen van gegevens in het petrischaalexperiment met mosterdbladluizen, parthenogenetische insecten, een uitdaging zijn vanwege hun snelle ontwikkeling en voortplanting. Het is moeilijk om onderscheid te maken tussen ingeënte volwassenen en hun nakomelingen zonder verwijdering. De details over hoe u verder moet gaan met deze stap worden zelden genoemd en sommige inconsistente factoren, zoals het bladverbruiksgebied, moeten worden geoptimaliseerd.
Dit protocol demonstreert een stabiel systeem voor het screenen van de virulentie van EPF-isolaten tegen mosterdbladluizen, waardoor potentiële isolaten tegen verschillende bladluissoorten uit een uitgebreide EPF-bibliotheek kunnen worden geselecteerd. In het veld verzamelde bladluizen kunnen worden geïdentificeerd en er kan een voldoende laboratoriumpopulatie van mosterdbladluizen worden vastgesteld om het bladluiseffect van verschillende schimmelisolaten te evalueren met behulp van een eenvoudige en haalbare methodologie met consistente resultaten. Bladluizen hebben meerdere evolutionaire mechanismen ontwikkeld als reactie op intense en herhaalde antropogene druk in agro-ecosystemen, wat een uitdaging vormt voor de voedselzekerheid9. Daarom zou deze beschreven methode kunnen worden uitgebreid om potentiële EPF-isolaten tegen verschillende bladluissoorten te evalueren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kruisbloemigen, een groep groenten, worden vaak aangetast door meerdere soorten bladluis, waaronder mosterdluis (L. erysimi) en koolluis (Brevicoryne brassicae)26. Beide soorten zijn gemeld in Taiwan27, en het is mogelijk dat ze naast elkaar bestaan op de verzamelplaats. Om nauw verwante bladluissoorten te onderscheiden, werd in dit onderzoek gebruik gemaakt van een moleculaire identificatietechniek met behulp van een multiplex primerset2…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door 109-2313-B-005 -048 -MY3 van het Ministerie van Wetenschap en Technologie (MOST).
Materials
| 10 μL Inoculating Loop | NEST Scientific | 718201 | |
| 100 bp DNA Ladder III | Geneaid | DL007 | |
| 2x SuperRed PCR Master Mix | Biotools | TE-SR01 | |
| 50 mL centrifuge tube | Bioman Scientific | ET5050-12 | |
| 6 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16021 | |
| 6 mm insect aspirator | MegaView Science | BA6001 | |
| 70 mm filter paper NO.1 | Toyo Roshi Kaisha | ||
| 70% ethanol | |||
| 9 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16001 | |
| Agar | Bioman Scientific | AGR001.1 | Microbiology grade |
| Agarose | Bioman Scientific | PB1200 | |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | Bioman Scientific | SDB001T | |
| Chromas | Technelysium | ||
| GeneDoc | |||
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH300 | https://www.geneaid.com/data/files/1605861013102532959.pdf |
| Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit | Protech Technology | PT-GD112-V3 | http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf |
| Hemocytometer | Paul Marienfeld | 640030 | |
| Komatsuna leaves (Brassica rapa var. perviridis) | Tai Cheng Farm | 1-010-300410 | |
| Microsprayer | |||
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| Mustard aphid (Lipaphis erysimi) | |||
| Painting brush | Tian Cheng brush company | 4716608400352 | |
| Parafilm M | Bemis | PM-996 | |
| Pellet pestle | Bioman Scientific | GT100R | |
| Sabouraud Dextrose Broth | HiMedia | MH033-500G | |
| SPSS Statistics | IBM | ||
| TAE buffer 50x | Bioman Scientific | TAE501000 | |
| Tween 80 | PanReac AppliChem | 142050.1661 |
Referências
- Ghosh, S., Roy, A., Chatterjee, A., Sikdar, S. R. Effect of regional wind circulation and meteorological factors on long-range migration of mustard aphids over indo-gangetic plain. Scientific Reports. 9, 5626 (2019).
- Dhillon, M. K., Singh, N., Yadava, D. K. Preventable yield losses and management of mustard aphid, Lipaphis erysimi (Kaltenbach) in different cultivars of Brassica juncea(L.) Czern & Coss. Crop Protection. 161, 106070 (2022).
- Huang, F., Hao, Z., Yan, F. Influence of oilseed rape seed treatment with imidacloprid on survival, feeding behavior, and detoxifying enzymes of mustard aphid, lipaphis erysimi. Insects. 10 (5), 144 (2019).
- Mannino, M. C., Huarte-Bonnet, C., Davyt-Colo, B., Pedrini, N. Is the insect cuticle the only entry gate for fungal infection? insights into alternative modes of action of entomopathogenic fungi. Journal of Fungi. 5 (2), 33 (2019).
- Bamisile, B. S., Akutse, K. S., Siddiqui, J. A., Xu, Y. Model application of entomopathogenic fungi as alternatives to chemical pesticides: prospects, challenges, and insights for next-generation sustainable agriculture. Frontiers in Plant Science. 12, 741804 (2021).
- Scorsetti, A. C., Humber, R. A., Garcia, J. J., Lopez Lastra, C. C. Natural occurrence of entomopathogenic fungi (Zygomycetes: Entomophthorales) of aphid (Hemiptera: Aphididae) pests of horticultural crops in Argentina. Biocontrol. 52, 641-655 (2007).
- Liu, Y. C., Ni, N. T., Chang, J. C., Li, Y. H., Lee, M. R., Kim, J. S., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882 (2021).
- Francis, F., Fingu-Mabola, J. C., Fekih, I. B. Direct and endophytic effects of fungal entomopathogens for sustainable aphid control: a review. Agriculture. 12 (12), 2081 (2022).
- Simon, J., Peccoud, J. Rapid evolution of aphid pests in agricultural environments. Current Opinion in Insect Science. 26, 17-24 (2018).
- Ujjan, A. A., Shahzad, S. Use of Entomopathogenic Fungi for the Control of Mustard Aphid (Lipaphis erysimi) on canola (Brassica napus L). Pakistan Journal of Botany. 44 (6), 2081-2086 (2012).
- Sajid, M., Bashir, N. H., Batool, Q., Munir, I., Bilal, M., Jamal, M. A., et al. In-vitro evaluation of biopesticides (Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Bacillus thuringiensis) against mustard aphid Lipaphis erysimi kalt. (Hemiptera: Aphididae). Journal of Entomology and Zoology Studies. 5 (6), 331-335 (2017).
- Paschapur, A. U., Subbanna, A. R. N. S., Singh, A. K., Jeevan, B., Stanley, J., Rajashekara, H., Mishra, K. K., Koti, P. S., Kant, L., Pattanayak, A. Alternaria alternata strain VLH1: a potential entomopathogenic fungus native to North Western Indian Himalayas. Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 138 (2022).
- Miohammed, A. A. Lecanicillium muscarium and Adalia bipunctata combination for the control of black bean aphid, Aphis fabae. Biocontrol. 63, 277-287 (2018).
- Thaochan, N., Ngampongsai, A., Prabhakar, C. S., Hu, Q. Beauveria bassiana PSUB01 simultaneously displays biocontrol activity against Lipaphis erysimi (Kalt.) (Hemiptera: Aphididae) and promotes plant growth in Chinese kale under hydroponic growing conditions. Biocontrol Science and Technology. 31 (10), 997-1015 (2021).
- Mseddi, J., Farhat-Touzri, D. B., Azzouz, H. Selection and characterization of thermotolerant Beauveria bassiana isolates and with insecticidal activity against the cotton-melon aphid Aphis gossypii (Glover) (Hemiptera: Aphididae). Pest Management Science. 78 (6), 2183-2195 (2022).
- Butt, T. M., Ibrahim, L., Clark, S. J., Beckett, A. The germination behaviour of Metarhizium anisopliae on the surface of aphid and flea beetle cuticles. Mycological Research. 99 (8), 945-950 (1995).
- Ullah, S., Raza, A. B. M., Alkafafy, M., Sayed, S., Hamid, M. I., Majeed, M. Z., Riaz, M. A., Gaber, N. M., Asim, M. Isolation, identification and virulence of indigenous entomopathogenic fungal strains against the peach-potato aphid, Myzus persicae Sulzer (Hemiptera: Aphididae), and the fall armyworm, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae). Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 2 (2022).
- Yokomi, R. K., Gottwald, T. R. Virulence of Verticillium lecanii Isolates in Aphids Determined by Detached-leaf Bioassay. Journal of Inbertebrate Pathology. 51, 250-258 (1988).
- Vu, V. H., Hong, S. I., Kim, K. Selection of entomopathogenic fungi for aphid control. Journal of Bioscience and Bioengineering. 104 (6), 498-505 (2007).
- Vandenberg, J. D. Standardized bioassay and screening of beauveria bassiana and paecilomyces fumosoroseus against the russian wheat aphid (homoptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 89 (6), 1418-1423 (1996).
- Lu, W. N., Wu, Y. T., Kuo, M. H. Development of species-specific primers for the identification of aphids in Taiwan. Applied Entomology and Zoology. 43 (1), 91-96 (2008).
- Liu, Y. C., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882 (2021).
- Menger, J., Beauzay, P., Chirumamilla, A., Dierks, C., Gavloski, J., Glogoza, P., et al. Implementation of a diagnostic-concentration bioassay for detection of susceptibility to pyrethroids in soybean aphid (hemiptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 113 (2), 932-939 (2020).
- Zhang, R., Chen, J., Jiang, L., Qiao, G. The genes expression difference between winged and wingless bird cherry-oat aphid Rhopalosiphum padi based on transcriptomic data. Scientific Reports. 9, 4754 (2019).
- Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. Journal of Economic Entomology. 18, 265-267 (1925).
- Liu, T. X., Sparks, A. N. . Aphids on Cruciferous Crops: Identification and Management. , 9-11 (2001).
- Kuo, M., Chianglin, H. Temperature dependent life table of brevicoryne brassicae (l.)(hemiptera: aphididae) on radish. Formosan Entomologist. 27, 293-302 (2007).
- Im, Y., Park, S., Lee, S. Y., Kim, J., Kim, J. J. Early-Stage defense mechanism of the cotton aphid aphis gossypii against infection with the insect-killing fungus beauveria bassiana JEF-544. Frontiers in Immunology. 13, 907088 (2022).
- Kim, J. J., Roberts, D. W. The relationship between conidial dose, moulting and insect developmental stage on the susceptibility of cotton aphid, Aphis gossypii, to conidia of Lecanicillium attenuatum, an entomopathogenic fungus. Biocontrol Science and Technology. 22 (3), 319-331 (2012).
- Reingold, V., Kottakota, C., Birnbaum, N., Goldenberg, M., Lebedev, G., Ghanim, M., et al. Intraspecies variation ofMetarhiziumbrunneumagainst the green peach aphid,Myzus persicae, provides insight into thecomplexity of disease progression. Pest Management Science. 77, 2557-2567 (2021).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Action on the Surface: entomopathogenic fungi versus the insect cuticle. Insects. 4, 357-374 (2013).
- Knodel, J. J., Beauzay, P., Boetel, M., Prochaska, T., Chirumamilla, A. . 2022 North Dakota Field Crop Insect Management Guide. , (2021).
- Yeo, H., Pell, J. K., Alderson, P. G., Clark, S. J., Pye, B. J. Laboratory evaluation of temperature effects on the germination and growth of entomopathogenic fungi and on their pathogenicity to two aphid species. Pest Management Science. 59 (2), 156-165 (2003).
- Erdos, Z., Chandler, D., Bass, C., Raymond, B. Controlling insecticide resistant clones of the aphid, Myzus persicae, using the entomopathogenic fungus Akanthomyces muscarius: fitness cost of resistance under pathogen challenge. Pest Management Science. 77 (11), 5286-5293 (2021).
