Valutazione dell'effetto afididida di funghi entomopatogeni contro insetti partenogenetici, afide della senape, Lipaphis erysimi (Kalt.)
Summary
Questo protocollo presenta un sistema ottimizzato di biodosaggio a foglia staccata per valutare l’efficacia dei funghi entomopatogeni (EPF) contro l’afide della senape (Lipaphis erysimi (Kalt.)), un insetto partenogenetico. Il metodo delinea il processo di raccolta dei dati durante gli esperimenti con piastre di Petri, consentendo ai ricercatori di misurare costantemente la virulenza dell’EPF contro gli afidi della senape e altri insetti partenogenetici.
Abstract
L’afide della senape (L. erysimi) è un parassita che infesta varie colture crocifere e trasmette virus vegetali. Per ottenere una gestione ecologica dei parassiti, i funghi entomopatogeni (EPF) sono potenziali agenti di controllo microbico per il controllo di questo parassita. Pertanto, lo screening della virulenza degli isolati di EPF in condizioni di piastra di Petri è necessario prima dell’applicazione sul campo. Tuttavia, l’afide della senape è un insetto partenogenetico, il che rende difficile registrare i dati durante gli esperimenti con piastre di Petri. Per affrontare questo problema è stato sviluppato un sistema modificato per i saggi biologici delle foglie distaccate, utilizzando un microspruzzatore per inoculare i conidi sugli afidi e prevenire l’annegamento facilitando l’essiccazione all’aria dopo la sospensione delle spore. Il sistema ha mantenuto un’elevata umidità relativa per tutto il periodo di osservazione e il disco fogliare è rimasto fresco per oltre dieci giorni, consentendo la riproduzione partenogenetica degli afidi. Per prevenire l’accumulo di prole, è stato implementato un processo di rimozione quotidiana utilizzando un pennello da pittura. Questo protocollo dimostra un sistema stabile per valutare la virulenza degli isolati di EPF contro gli afidi della senape o altri afidi, consentendo la selezione di potenziali isolati per il controllo degli afidi.
Introduction
L’afide della senape (L. erysimi) è un noto parassita che infesta una varietà di colture crocifere, causando notevoli perdite economiche1. Sebbene siano stati raccomandati diversi insetticidi sistematici per combattere le infestazioni di afidi, l’uso frequente di questi insetticidi solleva preoccupazioni sulla resistenza ai pesticidi 2,3. Pertanto, in termini di gestione ecologica dei parassiti, i funghi entomopatogeni (EPF) potrebbero fungere da adeguata strategia di controllo alternativa. L’EPF è un insetto patogeno con la capacità di infettare gli ospiti penetrando nelle loro cuticole, il che lo rende un potente agente per il controllo degli afidi e di altri insetti succhiatori delle piante4. Inoltre, l’EPF ha dimostrato di essere una tecnica di gestione dei parassiti fattibile e sostenibile, offrendo vantaggi come l’antagonismo dei patogeni delle piante e la promozione della crescita delle piante5.
L’EPF può essere ottenuto attraverso l’adescamento del suolo degli insetti o isolato dai cadaveri degli insetti nel campo 6,7. Tuttavia, prima di un ulteriore utilizzo di isolati fungini, è necessario uno screening della patogenicità. Sono stati condotti diversi studi sull’efficacia dell’EPF contro gli afidi, che sono importanti parassiti delle colture che possono causare gravi danni 8,9. Gli afidi della senape, tra le varie specie di afidi, sono stati testati per la suscettibilità a diversi ceppi di Beauveria spp., Metarhizium spp., Lecanicillium spp., Paecilomyces spp. e persino Alternaria, che è principalmente noto come fungo saprofita e patogeno delle piante, ma ha mostrato alcuni effetti letali contro gli afidi della senape10,11,12.
Per valutare l’efficacia dell’EPF contro gli afidi in condizioni di laboratorio, i saggi biologici possono essere suddivisi in due parti principali: la camera di inoculazione e l’inoculazione fungina. L’attuale protocollo descrive la costruzione di una camera di inoculazione, in cui gli afidi possono essere mantenuti utilizzando vari metodi, come una foglia asportata con un picciolo avvolto in cotone umido, un disco fogliare asportato con una capsula di Petri rivestita con carta da filtro inumidita, la manutenzione diretta sulle piante in vaso o un disco fogliare asportato incorporato in agar acquoso all’interno di una capsula di Petri o di un contenitore10, 11,13. I metodi comuni per l’inoculazione fungina includono l’irrorazione dei conidi, l’immersione degli afidi in una sospensione dei conidi, l’immersione delle foglie in una sospensione dei conidi e l’inoculazione degli endofitidelle piante 11,14,15,16. Sebbene esistano vari metodi di inoculazione, i saggi biologici dovrebbero simulare le condizioni di applicazione sul campo. Ad esempio, nel caso del metodo12,17 a immersione fogliare, è possibile valutare l’efficienza dell’EPF, ma poiché gli afidi infestano le foglie cariche di funghi, il lato dorsale dell’afide, che è un sito di penetrazione preferenziale, di solito non viene esposto al fungo.
Per valutare l’effetto afididida dell’EPF in condizioni di laboratorio, questo protocollo suggerisce di utilizzare il metodo della foglia staccata descritto da Yokomi e Gottwald18 con alcune modifiche, seguito dall’inoculazione dei conidi utilizzando un micro-spruzzatore. Questo metodo mantiene circa il 100% di umidità nella camera del biosaggio per almeno sette giorni senza richiedere un ulteriore reintegro di acqua18,19. Inoltre, confinare gli afidi su una superficie garantisce la loro esposizione all’irrorazione dei conidi e facilita le osservazioni20. Tuttavia, gli afidi possono rimanere bloccati nella superficie esposta dell’agar mentre si muovono all’interno della camera di inoculazione. Inoltre, la registrazione dei dati nell’esperimento della piastra di Petri con gli afidi della senape, che sono insetti partenogenetici, può essere difficile a causa del loro rapido sviluppo e riproduzione. È difficile distinguere tra gli adulti inoculati e la loro progenie senza rimozione. I dettagli su come procedere con questo passaggio sono raramente menzionati e alcuni fattori incoerenti, come l’area di consumo delle foglie, devono essere ottimizzati.
Questo protocollo dimostra un sistema stabile per lo screening della virulenza degli isolati di EPF contro gli afidi della senape, consentendo la selezione di potenziali isolati contro varie specie di afidi da un’ampia libreria di EPF. È possibile identificare gli afidi raccolti sul campo e stabilire una popolazione di laboratorio sufficiente di afidi della senape per valutare l’effetto afididida di vari isolati fungini utilizzando una metodologia semplice e fattibile con risultati coerenti. Gli afidi hanno sviluppato molteplici meccanismi evolutivi in risposta alle intense e ripetute pressioni antropogeniche negli agroecosistemi, ponendo sfide alla sicurezza alimentare9. Pertanto, questo metodo descritto potrebbe essere esteso per valutare potenziali isolati di EPF contro varie specie di afidi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le crucifere, un gruppo di ortaggi, sono spesso infestate da diverse specie di afidi, tra cui l’afide della senape (L. erysimi) e l’afide del cavolo (Brevicoryne brassicae)26. Entrambe le specie sono state segnalate a Taiwan27 ed è possibile che coesistano nel sito di raccolta. Per distinguere le specie di afidi strettamente correlate, questo studio ha impiegato una tecnica di identificazione molecolare utilizzando un set di primer multiplex<sup class="xr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata supportata dal numero 109-2313-B-005 -048 -MY3 del Ministero della Scienza e della Tecnologia (MOST).
Materials
| 10 μL Inoculating Loop | NEST Scientific | 718201 | |
| 100 bp DNA Ladder III | Geneaid | DL007 | |
| 2x SuperRed PCR Master Mix | Biotools | TE-SR01 | |
| 50 mL centrifuge tube | Bioman Scientific | ET5050-12 | |
| 6 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16021 | |
| 6 mm insect aspirator | MegaView Science | BA6001 | |
| 70 mm filter paper NO.1 | Toyo Roshi Kaisha | ||
| 70% ethanol | |||
| 9 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16001 | |
| Agar | Bioman Scientific | AGR001.1 | Microbiology grade |
| Agarose | Bioman Scientific | PB1200 | |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | Bioman Scientific | SDB001T | |
| Chromas | Technelysium | ||
| GeneDoc | |||
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH300 | https://www.geneaid.com/data/files/1605861013102532959.pdf |
| Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit | Protech Technology | PT-GD112-V3 | http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf |
| Hemocytometer | Paul Marienfeld | 640030 | |
| Komatsuna leaves (Brassica rapa var. perviridis) | Tai Cheng Farm | 1-010-300410 | |
| Microsprayer | |||
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| Mustard aphid (Lipaphis erysimi) | |||
| Painting brush | Tian Cheng brush company | 4716608400352 | |
| Parafilm M | Bemis | PM-996 | |
| Pellet pestle | Bioman Scientific | GT100R | |
| Sabouraud Dextrose Broth | HiMedia | MH033-500G | |
| SPSS Statistics | IBM | ||
| TAE buffer 50x | Bioman Scientific | TAE501000 | |
| Tween 80 | PanReac AppliChem | 142050.1661 |
Referências
- Ghosh, S., Roy, A., Chatterjee, A., Sikdar, S. R. Effect of regional wind circulation and meteorological factors on long-range migration of mustard aphids over indo-gangetic plain. Scientific Reports. 9, 5626 (2019).
- Dhillon, M. K., Singh, N., Yadava, D. K. Preventable yield losses and management of mustard aphid, Lipaphis erysimi (Kaltenbach) in different cultivars of Brassica juncea(L.) Czern & Coss. Crop Protection. 161, 106070 (2022).
- Huang, F., Hao, Z., Yan, F. Influence of oilseed rape seed treatment with imidacloprid on survival, feeding behavior, and detoxifying enzymes of mustard aphid, lipaphis erysimi. Insects. 10 (5), 144 (2019).
- Mannino, M. C., Huarte-Bonnet, C., Davyt-Colo, B., Pedrini, N. Is the insect cuticle the only entry gate for fungal infection? insights into alternative modes of action of entomopathogenic fungi. Journal of Fungi. 5 (2), 33 (2019).
- Bamisile, B. S., Akutse, K. S., Siddiqui, J. A., Xu, Y. Model application of entomopathogenic fungi as alternatives to chemical pesticides: prospects, challenges, and insights for next-generation sustainable agriculture. Frontiers in Plant Science. 12, 741804 (2021).
- Scorsetti, A. C., Humber, R. A., Garcia, J. J., Lopez Lastra, C. C. Natural occurrence of entomopathogenic fungi (Zygomycetes: Entomophthorales) of aphid (Hemiptera: Aphididae) pests of horticultural crops in Argentina. Biocontrol. 52, 641-655 (2007).
- Liu, Y. C., Ni, N. T., Chang, J. C., Li, Y. H., Lee, M. R., Kim, J. S., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882 (2021).
- Francis, F., Fingu-Mabola, J. C., Fekih, I. B. Direct and endophytic effects of fungal entomopathogens for sustainable aphid control: a review. Agriculture. 12 (12), 2081 (2022).
- Simon, J., Peccoud, J. Rapid evolution of aphid pests in agricultural environments. Current Opinion in Insect Science. 26, 17-24 (2018).
- Ujjan, A. A., Shahzad, S. Use of Entomopathogenic Fungi for the Control of Mustard Aphid (Lipaphis erysimi) on canola (Brassica napus L). Pakistan Journal of Botany. 44 (6), 2081-2086 (2012).
- Sajid, M., Bashir, N. H., Batool, Q., Munir, I., Bilal, M., Jamal, M. A., et al. In-vitro evaluation of biopesticides (Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Bacillus thuringiensis) against mustard aphid Lipaphis erysimi kalt. (Hemiptera: Aphididae). Journal of Entomology and Zoology Studies. 5 (6), 331-335 (2017).
- Paschapur, A. U., Subbanna, A. R. N. S., Singh, A. K., Jeevan, B., Stanley, J., Rajashekara, H., Mishra, K. K., Koti, P. S., Kant, L., Pattanayak, A. Alternaria alternata strain VLH1: a potential entomopathogenic fungus native to North Western Indian Himalayas. Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 138 (2022).
- Miohammed, A. A. Lecanicillium muscarium and Adalia bipunctata combination for the control of black bean aphid, Aphis fabae. Biocontrol. 63, 277-287 (2018).
- Thaochan, N., Ngampongsai, A., Prabhakar, C. S., Hu, Q. Beauveria bassiana PSUB01 simultaneously displays biocontrol activity against Lipaphis erysimi (Kalt.) (Hemiptera: Aphididae) and promotes plant growth in Chinese kale under hydroponic growing conditions. Biocontrol Science and Technology. 31 (10), 997-1015 (2021).
- Mseddi, J., Farhat-Touzri, D. B., Azzouz, H. Selection and characterization of thermotolerant Beauveria bassiana isolates and with insecticidal activity against the cotton-melon aphid Aphis gossypii (Glover) (Hemiptera: Aphididae). Pest Management Science. 78 (6), 2183-2195 (2022).
- Butt, T. M., Ibrahim, L., Clark, S. J., Beckett, A. The germination behaviour of Metarhizium anisopliae on the surface of aphid and flea beetle cuticles. Mycological Research. 99 (8), 945-950 (1995).
- Ullah, S., Raza, A. B. M., Alkafafy, M., Sayed, S., Hamid, M. I., Majeed, M. Z., Riaz, M. A., Gaber, N. M., Asim, M. Isolation, identification and virulence of indigenous entomopathogenic fungal strains against the peach-potato aphid, Myzus persicae Sulzer (Hemiptera: Aphididae), and the fall armyworm, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae). Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 2 (2022).
- Yokomi, R. K., Gottwald, T. R. Virulence of Verticillium lecanii Isolates in Aphids Determined by Detached-leaf Bioassay. Journal of Inbertebrate Pathology. 51, 250-258 (1988).
- Vu, V. H., Hong, S. I., Kim, K. Selection of entomopathogenic fungi for aphid control. Journal of Bioscience and Bioengineering. 104 (6), 498-505 (2007).
- Vandenberg, J. D. Standardized bioassay and screening of beauveria bassiana and paecilomyces fumosoroseus against the russian wheat aphid (homoptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 89 (6), 1418-1423 (1996).
- Lu, W. N., Wu, Y. T., Kuo, M. H. Development of species-specific primers for the identification of aphids in Taiwan. Applied Entomology and Zoology. 43 (1), 91-96 (2008).
- Liu, Y. C., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882 (2021).
- Menger, J., Beauzay, P., Chirumamilla, A., Dierks, C., Gavloski, J., Glogoza, P., et al. Implementation of a diagnostic-concentration bioassay for detection of susceptibility to pyrethroids in soybean aphid (hemiptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 113 (2), 932-939 (2020).
- Zhang, R., Chen, J., Jiang, L., Qiao, G. The genes expression difference between winged and wingless bird cherry-oat aphid Rhopalosiphum padi based on transcriptomic data. Scientific Reports. 9, 4754 (2019).
- Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. Journal of Economic Entomology. 18, 265-267 (1925).
- Liu, T. X., Sparks, A. N. . Aphids on Cruciferous Crops: Identification and Management. , 9-11 (2001).
- Kuo, M., Chianglin, H. Temperature dependent life table of brevicoryne brassicae (l.)(hemiptera: aphididae) on radish. Formosan Entomologist. 27, 293-302 (2007).
- Im, Y., Park, S., Lee, S. Y., Kim, J., Kim, J. J. Early-Stage defense mechanism of the cotton aphid aphis gossypii against infection with the insect-killing fungus beauveria bassiana JEF-544. Frontiers in Immunology. 13, 907088 (2022).
- Kim, J. J., Roberts, D. W. The relationship between conidial dose, moulting and insect developmental stage on the susceptibility of cotton aphid, Aphis gossypii, to conidia of Lecanicillium attenuatum, an entomopathogenic fungus. Biocontrol Science and Technology. 22 (3), 319-331 (2012).
- Reingold, V., Kottakota, C., Birnbaum, N., Goldenberg, M., Lebedev, G., Ghanim, M., et al. Intraspecies variation ofMetarhiziumbrunneumagainst the green peach aphid,Myzus persicae, provides insight into thecomplexity of disease progression. Pest Management Science. 77, 2557-2567 (2021).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Action on the Surface: entomopathogenic fungi versus the insect cuticle. Insects. 4, 357-374 (2013).
- Knodel, J. J., Beauzay, P., Boetel, M., Prochaska, T., Chirumamilla, A. . 2022 North Dakota Field Crop Insect Management Guide. , (2021).
- Yeo, H., Pell, J. K., Alderson, P. G., Clark, S. J., Pye, B. J. Laboratory evaluation of temperature effects on the germination and growth of entomopathogenic fungi and on their pathogenicity to two aphid species. Pest Management Science. 59 (2), 156-165 (2003).
- Erdos, Z., Chandler, D., Bass, C., Raymond, B. Controlling insecticide resistant clones of the aphid, Myzus persicae, using the entomopathogenic fungus Akanthomyces muscarius: fitness cost of resistance under pathogen challenge. Pest Management Science. 77 (11), 5286-5293 (2021).
