Optogenetisk hæmning af rho1-medieret actomyosinkontraktilitet kombineret med måling af epitelspænding i Drosophila-embryoner

Summary

Actomyosin kontraktilitet spiller en vigtig rolle i celle- og vævsmorfogenese. Det er imidlertid udfordrende at manipulere actomyosinkontraktilitet in vivo akut. Denne protokol beskriver et optogenetisk system, der hurtigt hæmmer Rho1-medieret actomyosinkontraktilitet i Drosophila-embryoner , hvilket afslører det øjeblikkelige tab af epitelspænding efter inaktivering af actomyosin in vivo.

Abstract

Kontraktile kræfter genereret af actin og ikke-muskelmyosin II (“actomyosin kontraktilitet”) er kritiske for morfologiske ændringer af celler og væv på flere længdeskalaer, såsom celledeling, cellemigration, epitelfoldning og forgrening af morfogenese. En dybdegående forståelse af actomyosinkontraktilitetens rolle i morfogenese kræver tilgange, der muliggør hurtig inaktivering af actomyosin, hvilket er vanskeligt at opnå ved anvendelse af konventionelle genetiske eller farmakologiske tilgange. Den præsenterede protokol demonstrerer brugen af et CRY2-CIBN-baseret optogenetisk dimeriseringssystem, Opto-Rho1DN, til at hæmme actomyosinkontraktilitet i Drosophila-embryoner med præcise tidsmæssige og rumlige kontroller. I dette system smeltes CRY2 sammen med den dominerende negative form af Rho1 (Rho1DN), mens CIBN er forankret til plasmamembranen. Blå lysmedieret dimerisering af CRY2 og CIBN resulterer i hurtig translokation af Rho1DN fra cytoplasmaet til plasmamembranen, hvor det inaktiverer actomyosin ved at hæmme endogen Rho1. Derudover præsenterer denne artikel en detaljeret protokol til kobling af Opto-Rho1DN-medieret inaktivering af actomyosin med laserablation for at undersøge actomyosins rolle i generering af epitelspænding under dannelse af Drosophila ventral fure. Denne protokol kan anvendes på mange andre morfologiske processer, der involverer actomyosin kontraktilitet i Drosophila-embryoner med minimale modifikationer. Samlet set er dette optogenetiske værktøj en kraftfuld tilgang til at dissekere funktionen af actomyosinkontraktilitet til styring af vævsmekanik under dynamisk vævsremodellering.

Introduction

Actomyosin kontraktilitet, den kontraktile kraft, der udøves af ikke-muskelmyosin II (herefter ‘myosin’) på F-actin-netværket, er en af de vigtigste kræfter i at ændre celleform og drive morfogenese på vævsniveau ^1,2. For eksempel resulterer aktiveringen af actomyosinkontraktilitet ved epitelcellernes apikale domæne i apikal indsnævring, hvilket letter en række morfogenetiske processer, herunder epitelfoldning, celleekstrudering, delaminering og sårheling 3,4,5,6,7 . Aktiveringen af myosin kræver phosphorylering af dens regulatoriske lyskæde. Denne modifikation lindrer den hæmmende konformation af myosinmolekylerne, så de kan danne bipolære myosinfilamentbundter med flere hoveddomæner i begge ender. De bipolære myosinfilamenter driver den antiparallelle bevægelse af actinfilamenter og resulterer i generering af kontraktil kraft ^1,8,9.

Den evolutionært bevarede Rho-familie lille GTPase RhoA (Rho1 i Drosophila) spiller en central rolle i aktiveringen af actomyosinkontraktilitet i forskellige cellulære sammenhænge^10,11. Rho1 fungerer som en bimolekylær switch ved at binde enten GTP (aktiv form) eller BNP (inaktiv form)¹². Kredsløbet mellem GTP- eller GDP-bundet Rho1 reguleres af dets GTPase-aktiverende proteiner (GAPs) og guaninnukleotidbytterfaktorer (GEF’er)¹³. GEF’er fungerer til at lette udvekslingen af BNP for GTP og dermed aktivere Rho1-aktivitet. GAPs forbedrer derimod GTPase-aktiviteten af Rho1 og deaktiverer således Rho1. Aktiveret Rho1 fremmer actomyosin kontraktilitet gennem interaktion med og aktivering af dets downstream effektorer, Rho-associeret kinase (Rok) og Diaphanous¹⁴. Rok inducerer myosinaktivering og actomyosinkontraktilitet ved phosphorylering af den regulatoriske lyskæde af myosin¹⁵. Derudover hæmmer Rok også myosinregulatorisk lyskædefosfatase og fremmer dermed yderligere myosinfilamentsamling¹⁶. Rok kan også phosphorylere LIM-kinaser, som, når de aktiveres, forhindrer aktinadskillelse ved phosphorylating og hæmmer actin-depolymeriseringsfaktoren cofilin^17,18. Diaphanous er en forminfamilie actinnukleator, der fremmer actinpolymerisation, hvilket giver en base for myosin at interagere med 19,20,21.

Mens de cellulære mekanismer, der aktiverer actomyosinkontraktilitet, er blevet godt belyst, forbliver vores forståelse af dens funktion i regulering af dynamisk vævsremodellering ufuldstændig. At udfylde dette videnshul kræver tilgange, der hurtigt kan inaktivere actomyosin på specifikke vævsregioner in vivo og registrere den umiddelbare indvirkning på vævsadfærd og egenskaber. Denne protokol beskriver brugen af en optogenetisk tilgang til akut hæmme actomyosinkontraktilitet under Drosophila mesoderm invagination, efterfulgt af måling af epitelspænding ved hjælp af laserablation. Under Drosophila gastrulation gennemgår de ventralt lokaliserede mesoderm-forløberceller apikal indsnævring og invaginat fra embryoets overflade ved at danne en anterior-posteriort orienteret fure^22,23. Dannelsen af ventrale furer har længe været brugt som en model til undersøgelse af mekanismen for epitelfoldning. Ventral furedannelse administreres af det dorsal-ventrale mønstersystem i Drosophila^24,25,26,27. Ekspressionen af to transkriptionsfaktorer, Twist og Snail, placeret på den ventrale side af embryoet, styrer ventral furedannelse og specificerer mesodermal celleskæbne²⁸. Twist and Snail aktiverer rekrutteringen af Rho1 GEF RhoGEF2 til toppen af mesoderm-forløbercellerne via en G-proteinkoblet receptorvej og et RhoGEF2-adaptorprotein, T48 29,30,31,32,33^. Dernæst aktiverer RhoGEF2 myosin gennem den apikale overflade af den potentielle mesoderm gennem Rho-Rho-kinasevejen 34,35,36,37,38,39. Aktiveret myosin danner et supracellulært actomyosinnetværk gennem den apikale overflade af mesoderm primordium, hvis sammentrækninger driver apikal indsnævring og resulterer i en hurtig stigning i apikal vævsspænding 14,37,40.

Det optogenetiske værktøj beskrevet i denne protokol, Opto-Rho1DN, hæmmer actomyosinkontraktilitet gennem blålysafhængig plasmamembranrekruttering af en dominerende negativ form af Rho1 (Rho1DN)⁴¹. En T19N-mutation i Rho1DN eliminerer det mutante proteins evne til at udveksle BNP med GTP og gør dermed proteinet evigt inaktivt³⁴. En efterfølgende mutation i Rho1DN, C189Y, eliminerer dets naive membranmålretningssignal^42,43. Når Rho1DN infunderes til plasmamembranen, binder det sig til og beslaglægger Rho1 GEF’er og blokerer derved aktiveringen af Rho1 såvel som Rho1-medieret aktivering af myosin og actin^34,44. Plasmamembranrekrutteringen af Rho1DN opnås gennem et lysafhængigt dimeriseringsmodul afledt af Cryptochrome 2 og dets bindingspartner CIB1. Cryptochrome 2 er en blå-lys aktiveret Cryptochrome fotoreceptor i Arabidopsis thaliana⁴⁵. Cryptochrome 2 binder kun til CIB1, et basisk helix-loop-helix-protein, i sin fotoexciterede tilstand⁴⁵. Det blev senere konstateret, at den konserverede N-terminale, fotolyasehomologiske region (PHR), fra Cryptochrome 2 (CRY2_PHR, i det følgende benævnt CRY2) og det N-terminale domæne (aa 1-170) af CIB1 (herefter CIBN) er vigtige for lysinduceret dimerisering⁴⁶. Opto-Rho1DN indeholder to komponenter. Den første komponent er CIBN-proteinet fusioneret med et CAAX-anker, som lokaliserer proteinet til plasmamembranen⁴⁷. Den anden komponent er mCherry-tagget CRY2 smeltet sammen med Rho1DN⁴¹. I mangel af blåt lys forbliver CRY2-Rho1DN i cytoplasmaet. Ved stimulering af blåt lys målrettes CRY2-Rho1DN mod plasmamembranen gennem interaktionen mellem membranforankret CIBN og exciteret CRY2. Opto-Rho1DN kan aktiveres af ultraviolet A (UVA) lys og blåt lys (400-500 nm, maksimal aktivering ved 450-488 nm) eller af en 830-980 nm pulserende laser, når der udføres to-fotonstimulering^41,46,47,48. Derfor stimuleres Opto-Rho1DN af bølgelængder, der normalt bruges til spændende GFP (488 nm til enkeltfotonbilleddannelse og 920 nm til to-fotonbilleddannelse). I modsætning hertil stimulerer bølgelængder, der almindeligvis anvendes til spændende mCherry (561 nm til enkeltfotonbilleddannelse og 1.040 nm til to-fotonbilleddannelse) ikke det optogenetiske modul og kan derfor bruges til præstimuleringsbilleddannelse. Protokollen beskriver de tilgange, der anvendes til at minimere risikoen for uønsket stimulering under prøvemanipulation.

Laserablation er blevet anvendt i vid udstrækning til at detektere og måle spændinger i celler og væv⁴⁹. Tidligere undersøgelser har vist, at når laserintensiteten kontrolleres korrekt, kan to-foton laserablation, der anvender en femtosekund nær-infrarød laser, fysisk forringe nogle subcellulære strukturer (f.eks. Kortikale actomyosinnetværk) uden at forårsage plasmamembranhenrykkelse^50,51. Hvis vævet er under spænding, resulterer laserablation af et område af interesse i vævet i en øjeblikkelig udadgående rekyl af cellerne ved siden af det ablerede område. Rekylhastigheden er en funktion af størrelsen af spændingen og viskositeten af mediet (cytoplasma), der omgiver de strukturer, der gennemgår rekyl⁴⁹. På grund af den overlegne penetrationsdybde af de nær-infrarøde lasere og evnen til at opnå godt begrænset fokal ablation er to-foton laserablation særlig nyttig til påvisning af vævsspænding in vivo. Som demonstreret i denne protokol kan denne metode let kombineres med Opto-Rho1DN-medieret inaktivering af actomyosinkontraktilitet for at undersøge den direkte virkning af Rho1-afhængig cellulær kontraktilitet på vævsmekanik under dynamisk vævsremodellering.

Protocol

1. Opsætning af det genetiske kryds og klargøring af ægopsamlingskoppen Vælg hunfluer (jomfru) fra den optogenetiske linje UASp-CIBNpm (I); UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry (III) på en CO2 -pude under et stereomikroskop og opsatte et kryds med hanfluer fra moderens GAL4 -førerlinje 67 Sqh-mCherry; 15 E-cadherin-GFP.BEMÆRK: 67 og 15 står for moder-Tubulin-GAL4 indsat i henholdsvis anden (II) og tredje (III) kromosomer,52. GAL4-linjen, der anvendes i denne p…

Representative Results

I de ustimulerede embryoner, der gennemgik apikal indsnævring, blev Sqh-mCherry beriget i den medioapikale region af de ventrale mesodermale celler, mens CRY2-Rho1DN-mCherry var cytosolisk (figur 1A). Laserablation inden for indsnævringsdomænet førte til en hurtig vævsrekyl langs A-P-aksen (figur 1B, C). I de stimulerede embryoner blev CRY2-Rho1DN-mCherry-signalet plasmamembranlokaliseret, mens det medioapiske signal fra Sqh-mCherry forsvan…

Discussion

Denne protokol beskrev den kombinerede anvendelse af optogenetik og laserablation til sondeændringer i vævsspænding umiddelbart efter inaktivering af actomyosinkontraktilitet. Det optogenetiske værktøj, der beskrives her, udnytter den dominerende negative form af Rho1 (Rho1DN) til akut at hæmme endogen Rho1 og Rho1-afhængig actomyosinkontraktilitet. Tidligere karakterisering af Opto-Rho1DN i forbindelse med Drosophila ventral furedannelse viste, at værktøjet er yderst effektivt til at formidle den hurti…

Materials

35 mm glass-bottom dish	MatTek	P35G-1.5-10-C	Used for sample preparation
60 mm × 15 mm Petri dish with lid	Falcon	351007	Used for sample preparation
Black cloth for covering the microscope	Online	NA	Used to avoid unwanted light stimulation
Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite)	VWR	10028-048	Used for embryo dechorination
CO2 pad	Genesee Scientific	59-114	Used for cross set-up
ddH2O	NA	NA	Used for sample preparation
Dumont Style 5 tweezers	VWR	102091-654	Used for sample preparation
Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2)	VWR	22940-834	Used for sample preparation
FluoView (Software)	Olympus	NA	Used for image acquisition and optogenetic stimulation
Halocarbon oil 27	Sigma Aldrich	H8773-100ML	Used for embryo stage visualization
ImageJ/FIJI	NIH	NA	Used for image analysis
MATLAB	MathWorks	NA	Used for image analysis
Nikon SMZ-745 stereoscope	Nikon	NA	Used for sample preparation
Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light.	Olympus	NA	Used for image acquisition and optogenetic stimulation
SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer)	VWR	30621-392	Used to avoid unwanted light stimulation
UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield)	Bolioptics	FM14036151	Used to avoid unwanted light stimulation
VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights	Amazon	NA	Used to avoid unwanted light stimulation