Denne protokol fremhæver en modificeret metode til påvisning og kvantificering af DNA-protein-tværbindinger (DPC’er) og deres posttranslationelle modifikationer (PTM’er), herunder ubiquitylering, SUMOylering og ADP-ribosylering induceret af topoisomerasehæmmere og formaldehyd, hvilket muliggør undersøgelse af dannelse og reparation af DPC’er og deres PTM’er.
DNA-protein-tværbindinger (DPC’er) er hyppige, allestedsnærværende og skadelige DNA-læsioner, der opstår fra endogene DNA-skader, enzym (topoisomeraser, methyltransferaser osv.), Der ikke fungerer korrekt, eller eksogene midler såsom kemoterapeutika og tværbindingsmidler. Når DPC’er er induceret, konjugeres flere typer posttranslationelle modifikationer (PTM’er) straks til dem som tidlige reaktionsmekanismer. Det har vist sig, at DPC’er kan modificeres af ubiquitin, lille ubiquitin-lignende modifikator (SUMO) og poly-ADP-ribose, som primer substraterne for at signalere deres respektive udpegede reparationsenzymer og i nogle tilfælde koordinere reparationen på sekventielle måder. Da PTM’er transspirerer hurtigt og er meget reversible, har det været udfordrende at isolere og detektere PTM-konjugerede DPC’er, der normalt forbliver på lave niveauer. Præsenteret her er et immunoassay til oprensning og kvantitativt detektering af ubiquitylerede, SUMOylerede og ADP-ribosylerede DPC’er (lægemiddelinducerede topoisomerase DPC’er og aldehydinducerede ikke-specifikke DPC’er) in vivo. Dette assay er afledt af RADAR-assayet (hurtig tilgang til DNA-adduktgendannelse), der anvendes til isolering af genomisk DNA indeholdende DPC’er ved ethanoludfældning. Efter normalisering og nukleasefordøjelse detekteres PTM’er af DPC’er, herunder ubiquitylering, SUMOylering og ADP-ribosylering, ved immunoblotting under anvendelse af deres tilsvarende antistoffer. Dette robuste assay kan bruges til at identificere og karakterisere nye molekylære mekanismer, der reparerer enzymatiske og ikke-enzymatiske DPC’er og har potentialet til at opdage små molekylehæmmere rettet mod specifikke faktorer, der regulerer PTM’er til reparation af DPC’er.
Genomisk DNA-skade opstår på grund af spontant henfald, intern skade og miljøfaktorer1. De resulterende DNA-læsioner omfatter beskadigede baser, mismatch, enkelt- og dobbeltstrengsbrud, inter- og intrastrengstværbindinger og DNA-protein-tværbindinger (DPC’er). En DPC dannes, når et kromatinbundet protein fanges på DNA gennem kovalent binding. DPC’er induceres af endogene DNA-læsioner og reaktive metabolitter såvel som eksogene midler såsom kemoterapeutika og bifunktionelle tværbindingsmidler. Under visse omstændigheder kan enzymdysfunktion også føre til dannelsen af DPC’er2. Den store forskel i DPC-induktorer resulterer i en forskel i identiteten af det kovalentbundne protein, kromosomområdet, hvor DPC’en dannes, strukturtypen af DNA’et, der er tværbundet til proteinet, og den kemiske egenskab af den kovalente binding mellem proteinet og DNA 2,3,4.
Baseret på deres kemiske natur kategoriseres DPC’er generelt i to grupper: enzymatiske DPC’er og ikke-enzymatiske DPC’er. Visse enzymer såsom topoisomeraser, glycosylaser og methyl / acyltransferaser virker ved at danne reversible enzym-DNA-kovalente mellemprodukter under deres normale katalytiske reaktioner. Disse er kortlivede enzym-DNA-mellemprodukter og kan omdannes til langlivede enzymatiske DPC’er ved deres fangst af endogene eller eksogene midler, især ved kemoterapeutika3. Topoisomerase DPC’er er blandt de hyppigste enzymatiske DPC’er i eukaryote celler, som kan genereres af klinisk nyttige topoisomerasehæmmere (topotecan og irinotecan til topoisomerase I [TOP1] og etoposid og doxorubicin til topoisomerase II [TOP2]) og er de primære terapeutiske mekanismer for disse hæmmere 5,6. DNA-methyltransferaser (DNMT) 1, 3A og 3B er målet for 5-aza-2′-deoxycytidin (også kendt som decitabin) og danner DPC’er ved eksponering for lægemidlet7. Reaktive midler, såvel som ultraviolet lys og ioniserende stråling, inducerer ikke-enzymatiske DPC’er ved ikke-specifikt tværbindende proteiner til DNA. Reaktive aldehyder såsom acetaldehyd og formaldehyd (FA) genereres ofte som biprodukter af cellulære metabolismer, blandt hvilke FA produceres ved mikromolære koncentrationer under methanolmetabolisme, lipidperoxidation og histondemethylering. FA er også et højvolumenproduktionskemikalie fremstillet over hele verden, som mange mennesker udsættes for både miljømæssigt og erhvervsmæssigt 8,9.
Både enzymatiske og ikke-enzymatiske DPC’er er meget giftige for celler, da deres voluminøse proteinkomponenter effektivt hindrer næsten alle kromatinbaserede processer, herunder replikation og transkription, hvilket fører til cellecyklusstop og apoptose, hvis de ikke repareres. I løbet af de sidste to årtier er reparationen af DPC’er blevet grundigt undersøgt, og flere proteiner / veje er blevet identificeret som nøglefaktorer, der enten direkte reparerer DPC’er eller modulerer deres reparationsprocesser. For eksempel har det været veletableret, at proteolyse af proteinmassen af en DPC er et afgørende trin i DPC-reparation, og at proteolyse kan katalyseres af proteaserne SPRTN 10,11,12,13,14, FAM111A15, GCNA 16,17 eller 26S-proteasomkomplekset 18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27 på en celletype- eller cellulær kontekstafhængig måde. Identifikation og karakterisering af disse proteaser har i vid udstrækning været afhængig af in vivo-komplekset af enzymet (ICE) assay28,29 og den hurtige tilgang til DNA-adduktgendannelse (RADAR) assay30,31, som begge isolerer DNA-molekyler og deres kovalentbundne proteiner fra frie cellulære proteiner for at muliggøre påvisning af DPC’er ved slot-blot ved hjælp af antistoffer rettet mod de tværbundne proteiner. Også den fangede agarose-DNA-immunfarvning (TARDIS) assay blev anvendt som et middel til at detektere og kvantificere DPC’er på enkeltcelleniveau32. I øjeblikket vælger forskere RADAR-analysen frem for ICE-analysen til måling af DPC’er, da ICE-analysen er afhængig af oprensning af nukleinsyrer ved hjælp af cæsiumchloridgradientultracentrifugering, hvilket er ekstremt tidskrævende, mens RADAR-analysen udfælder nukleinsyrer ved anvendelse af ethanol inden for en meget kortere periode.
I de senere år er der fremkommet stigende beviser for, at flere posttranslationelle modifikationer (PTM’er) er involveret i signalering og rekruttering af DPC-målrettede proteaser 3,33,34,35. For eksempel viste både TOP1- og TOP2-DPC’er sig at være konjugeret af lille ubiquitin-lignende modifikator (SUMO)-2/3 og derefter SUMO-1 af SUMO E3-ligaasen PIAS4, uafhængigt af DNA-replikation og transkription. De sekventielle SUMO-modifikationer ser ud til at være et mål for ubiquitin, som deponeres til SUMOylerede TOP-DPC’er og danner polymere kæder gennem dets lysin 48-rest af en SUMO-målrettet ubiquitinligase kaldet RNF4. Derefter fremkalder ubiquitinpolymeren et signal til og rekrutterer 26S-proteasomet til TOP-DPC’er23,36. Den samme SUMO-ubiquitin-vej viste sig for nylig at virke på DNMT1-DPC’er såvel som PARP-DNA-komplekser til deres reparation37,38. Derudover er SUMO-uafhængig ubiquitylering af ubiquitin E3-ligase TRAIP blevet rapporteret til primære DPC’er for proteasomal nedbrydning på en replikationskoblet måde39. I lighed med den proteasomale nedbrydning af TOP-DPC’er kræver proteolyse af enzymatiske og ikke-enzymatiske DPC’er af replikationskoblet metalloprotease SPRTN også ubiquitylering af DPC-substraterne som en mekanisme til at engagere SPRTN40,41. Afgrænsning af SUMOylerings og ubiquitylerings rolle kræver påvisning af DPC’er, der er markeret med disse PTM’er. Da det originale ICE-assay og RADAR-assay er afhængige af slot-blot/dot-blot-apparat til måling af ufordøjede DNA-prøver, er ingen af disse to assays i stand til at opløse og visualisere PTM-konjugerede DPC-arter med forskellige molekylvægte. For at overvinde dette problem fordøjede vi DNA-prøverne efter deres oprensning ved ethanoludfældning og prøvenormalisering med mikrokoknuklease, en DNA- og RNA-endo-eksonuklease for at frigive de tværbundne proteiner, hvilket gjorde det muligt for os at løse proteinerne såvel som deres kovalente PTM’er med natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE). Elektroforesen gjorde det muligt for os at detektere og kvantificere PTM-konjugerede DPC’er ved hjælp af specifikke antistoffer rettet mod PTM’erne. Vi kaldte oprindeligt denne forbedrede metode DUST-analysen for at fremhæve dens robusthed i detekteringen af ubiquitylerede og SUMOylerede TOP-DPC’er23. Senere udvidede vi brugen af analysen til kvantitativt at vurdere ADP-ribosylering af TOP1-DPC’er in vivo ved hjælp af antistoffer mod poly-ADP-ribosepolymerer20.
Præsenteret her er en detaljeret protokol til analysen, der registrerer og måler ubiquitylerede, SUMOylerede og ADP-ribosylerede DPC’er, som blev optimeret til de modificerede TOP-DPC’er, der induceres af deres hæmmere og ikke-specifikke / ikke-enzymatiske DPC’er, der induceres af FA. Dette assay isolerer PTM-konjugerede DPC’er ved at lysere celler med et kaotropisk middel, udfælde DNA med ethanol og frigive de ellers tværbundne proteiner og deres modifikatorer med mikrokoknuklease. De ellers DNA-bundne proteiner og deres PTM’er kvantificeres ved immunoblotting ved hjælp af specifikke antistoffer. Dette assay baner en ny vej til at belyse de molekylære mekanismer, hvormed cellen reparerer både enzymatiske og ikke-enzymatiske DPC’er. Det muliggør specifikt detaljerede undersøgelser af induktion og kinetik af PTM’er, der er vigtige for reguleringen af TOP-DPC-nedbrydning og reparation, og gør det således muligt at opdage nye faktorer såsom E3-ligaser, der dikterer PTM’erne. samt hæmmere rettet mod disse faktorer. Da nogle af de PTM’er, der er ansvarlige for TOP-DPC-reparation, sandsynligvis er involveret i reparation af DPC’er induceret af andre kemoterapeutika, såsom platinbaserede lægemidler22, har dette assay også potentialet til anvendelse til opdagelse af nye lægemidler og rationel optimering af kombinatoriske terapier med topoisomerasehæmmere eller platinbaseret antineoplast i patientceller for at vejlede behandlingsregimer.
Den beskrevne metode tillader måling af enzymatiske og ikke-enzymatiske DNA-protein-tværbindinger i pattedyrceller og er den eneste egnede tilgang til at studere deres ubiquitylering, SUMOylering og ADP-ribosylering. Slot-blotting efter ICE- eller RADAR-analysen muliggør hurtig påvisning af specifikke enzymatiske DPC’er såsom TOP-DPC’er ved hjælp af deres antistoffer. En advarsel til denne metode er imidlertid dens manglende evne til at adskille proteiner med forskellige molekylvægte, hvilket gør det umuligt at bestemme størrelserne af PTM-konjugerede DPC’er. Den beskrevne metode løser problemet ved at frigive tværbundne proteiner med mikrokoknuklease, som nedbryder DNA til oligonukleotider med terminale 3′-fosfater, hvorved proteinerne (konjugeret med oligonukleotider) tillades ved SDS-PAGE. DPC’er modificeret med ubiquitin-, SUMO- eller ADP-ribosemonomerer og polymerer af forskellig størrelse kan derfor visualiseres og kvantificeres af antistoffer rettet mod disse PTM’er, hvilket muliggør detaljeret undersøgelse af deres dannelse og kinetik. For at sikre reproducerbarhed og beregne statistisk signifikans kræves biologiske replikater af eksperimenterne.
Et af de mest almindelige problemer med dette assay er lavt DNA-udbytte efter ethanoludfældning. På den ene side kan DNA-udbyttet øges med mere udgangsmateriale (celler). På den anden side kan inkubation af cellelysater med ethanol i en flad plade snarere end et Eppendorf-rør markant forbedre aggregeringen af DNA-molekyler og dermed lette deres udfældning. Ikke-specifikke signaler observeret i prøver uden lægemiddelbehandling kan indikere ikke-kovalent proteinkontaminering. Hvis dette er tilfældet, kan man overveje at vaske DNA-pellets med høj saltbuffer for at fjerne forurenende stoffer inden sonikering. Det anbefales også at spinde ned DNA-prøver efter sonikering og mikrokoknuklease fordøjelse og kassere enhver uopløselig. I tilfælde af dårligt eller intet signal kan flere potentielle løsninger forsøges. For det første kan man øge belastningsmængden af DNA til SDS-PAGE og immunoblotting. For at gøre SUMOylerede og ubiquitylerede DPC-arter detekterbare, anbefales det at indlæse mindst 4 μg DNA på gelen. For det andet kan man øge lægemiddelkoncentrationerne for at inducere højere niveauer af DPC’er og deres tilknyttede PTM’er. For det tredje foreslås det at inkubere blots med primære antistoffer i en anden dag, hvis bånd / udstrygninger synes at være svage. En 2-dages inkubation kan forstærke signalet betydeligt og dermed reducere biologisk variabilitet fra uafhængige forsøg23. Membranstripning til genfarvning resulterer uundgåeligt i tab af en vis mængde PTM-konjugerede DPC-arter, der allerede er i lav overflod. Derfor anbefales det stærkt at køre separate geler til ubiquitin og SUMO detektion i stedet for at undersøge en blot. Derudover skal DNA-pellets vaskes med 75% ethanol for at fjerne det resterende DNAzol indeholdende guanidinsalt før opløsning i H2O eller andre opløsningsmidler, som ellers forårsager krystallisering af prøven efter tilsætning af Laemmli påfyldningsbuffer.
Arbejdsgangen for den beskrevne metode er meget mere tidseffektiv sammenlignet med det besværlige ICE-assay, da det er afhængigt af hurtig ethanoludfældning i stedet for den tidskrævende cæsiumchloridultracentrifugering for at isolere genomisk DNA. Til en pris medfører ethanolbaseret rensning en lav mængde proteinkontaminanter, der normalt er ubetydelige til immundetektion. Men når det kommer til analytiske undersøgelser, såsom massespektrometribaseret proteomisk analyse eller næste generations sekventering, der kræver nøjagtighed og præcision, er cæsium-chloriddensitet-gradientcentrifugering stadig en mere pålidelig tilgang til isolering af rent DNA med høj forekomst. Denne metode kan også potentielt anvendes til profilering af modifikationssteder på tværbundne proteiner og bestemmelse af bindingstyper af poly-ubiquitylering og poly-SUMOylering ved hjælp af korrekte massespektrometribaserede metoder.
Bemærk, at dette assay tillader identifikation og karakterisering af faktorer, der regulerer PTM’er til DPC’er reparation. For eksempel er upartiske screeningsmetoder med høj kapacitet (RNA-interferens og CRISPR) kraftfulde værktøjer til at opdage ubiquitin E3-ligaser, SUMO E3-ligaser og deres tilknyttede cofaktorer, der mindsker cytotoksicitet af DPC-induktorer. Den beskrevne metode muliggør molekylær validering af disse proteiner ved at bestemme, om de hjælper celler med at overleve DPC-induktorer ved at reparere DPC’erne. Nye småmolekylehæmmere rettet mod disse proteiner, der er identificeret for eksempel ved virtuel screening, kan også valideres ved hjælp af denne protokol. I betragtning af at topoisomerasehæmmere er blandt de mest ordinerede kemoterapeutika, kan dette robuste assay udvikles som et værktøj til udvikling af lægemidler, der synergiserer med kliniske topoisomerasehæmmere.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev delvist støttet af National Cancer Institute Center for Cancer ResearchExcellence in Postdoctoral Research Transition Award.
10x Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher | 70011069 | |
4–20% precast polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561096 | |
4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
AcquaStain (coomassie blue) | Bulldog Bio | AS001000 | |
anti-dsDNA (mouse monoclonal) | Abcam | 27156 | 1: 5,000 dilution is recommended |
anti-PAR (mouse monoclonal) | R&D systems | 4335-MC-100 | 1: 500 dilution is recommended |
anti-SUMO-1(rabbit monoclonal) | Cell Signaling Technology | 4940 | 1: 250 dilution is recommended |
anti-SUMO-2/3 (rabbit monoclonal) | Cell Signaling Technology | 4971 | 1: 250 dilution is recommended |
anti-TOP1 (mouse monoclonal) | BD Biosciences | 556597 | 1: 500 dilution is recommended |
anti-TOP2α (mouse monoclonal) | Santa Cruz Biotechnology | SC-365799 | 1: 250 dilution is recommended |
anti-TOP2β (mouse monoclonal) | Santa Cruz Biotechnology | SC-25330 | 1: 250 dilution is recommended |
anti-ubiquitin (mouse monoclonal) | Santa Cruz Biotechnology | SC-8017 | 1: 100 dilution is recommended |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 499609 | Used for micrococcal nuclease digestion |
Camptothecin | Sigma-Aldrich | PHL89593 | |
ChemiDo MP imaging system | Bio-Rad | 12003154 | |
Disodium phosphate | Sigma-Aldrich | 5438380100 | Used to make sodium phosphate buffer |
DNAzol | Thermo Fisher | 10503027 | |
DTT (dithiothreitol) | Thermo Fisher | R0861 | |
Dulbecco's modified eagle's medium | Sigma-Aldrich | 11965084 | |
Ethyl alcohol, 200 proof | Sigma-Aldrich | E7023 | |
Etoposide | Sigma-Aldrich | 1268808 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 47608 | |
Graphpad Prism Software | GraphStats | Prism 9.0.0 | |
HRP-linked Mouse IgG | Cytiva | NA931 | 1: 5,000 dilution is recommended |
HRP-linked Rabbit IgG | Cytiva | NA934 | 1: 5,000 dilution is recommended |
ImageJ Software | NIH, USA | ImageJ 1.53e | |
L-Glutamine | Fisher Scientific | 25030081 | |
Maximum sensitivity ECL substrate | Thermo Fisher | 34095 | |
Micrococcal nuclease | New England BioLabs | M0247S | |
Monosodium phosphate | Sigma-Aldrich | S3139 | Used to make sodium phosphate buffer |
NanoDrop 2000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | |
N-ethylmaleimide | Thermo Fisher | 23030 | DeSUMOylation/deubiquitylation inhibitor |
Nitrocellulose membrane, 0.45 µm | Bio-Rad | 1620115 | |
Non-fat dry milk | Bio-Rad | 1706404XTU | |
PDD00017273 | Selleckchem | S8862 | Poly(ADP-ribose) glycohydrolase inhibitor |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
Protease inhibitor cocktail | Thermo Fisher | 78430 | |
Q700 sonicator | Qsonica | Q700-110 | |
Ready-to-assemble PVDF transfer kit | Bio-Rad | 1704274 | |
Slot-blot apparatus | Bio-Rad | 1706542 | |
Slot-blot filter paper | Bio-Rad | 1620161 | |
Trans-Blot turbo transfer system | Bio-Rad | 1704150 | |
Tris/Glycine/SDS electrophoresis buffer | Bio-Rad | 1610732 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P3179 | |
Vertical electrophoresis cell | Bio-Rad | 1658004 |