वर्तमान प्रोटोकॉल डीएनए-प्रोटीन क्रॉसलिंक (डीपीसी) और उनके पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों (पीटीएम) का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक संशोधित विधि पर प्रकाश डालता है, जिसमें सर्वव्यापकता, सूमोनाइलेशन और एडीपी-राइबोसिलेशन शामिल हैं, जो टोपोइसोमेरेस इनहिबिटर और फॉर्मलाडेहाइड द्वारा प्रेरित होते हैं, जिससे डीपीसी और उनके पीटीएम के गठन और मरम्मत के अध्ययन की अनुमति मिलती है।
डीएनए-प्रोटीन क्रॉसलिंक (डीपीसी) लगातार, सर्वव्यापी और हानिकारक डीएनए घाव हैं, जो अंतर्जात डीएनए क्षति, एंजाइम (टोपोइसोमेरेस, मेथिलट्रांसफेरेज़, आदि) खराबी, या बहिर्जात एजेंटों जैसे कि कीमोथेरेपी और क्रॉसलिंकिंग एजेंटों से उत्पन्न होते हैं। एक बार जब डीपीसी को प्रेरित किया जाता है, तो कई प्रकार के पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन (पीटीएम) तुरंत प्रारंभिक प्रतिक्रिया तंत्र के रूप में संयुग्मित होते हैं। यह दिखाया गया है कि डीपीसी को यूबिकिटिन, छोटे यूबिकिटिन-जैसे संशोधक (सूमो), और पॉली-एडीपी-राइबोस द्वारा संशोधित किया जा सकता है, जो सब्सट्रेट्स को अपने संबंधित मरम्मत एंजाइमों को संकेत देने के लिए प्राइम करते हैं और कुछ मामलों में, अनुक्रमिक शिष्टाचार में मरम्मत का समन्वय करते हैं। चूंकि पीटीएम जल्दी से प्रकट होते हैं और अत्यधिक प्रतिवर्ती होते हैं, इसलिए पीटीएम-संयुग्मित डीपीसी को अलग करना और पता लगाना चुनौतीपूर्ण रहा है जो आमतौर पर निम्न स्तर पर रहते हैं। यहां प्रस्तुत विवो में सर्वव्यापक, सूमोइलेटेड और एडीपी-राइबोसिलेटेड डीपीसी (दवा-प्रेरित टोपोइसोमेरेस डीपीसी और एल्डिहाइड-प्रेरित गैर-विशिष्ट डीपीसी) को शुद्ध करने और मात्रात्मक रूप से पता लगाने के लिए एक इम्यूनोसे है। यह परख रडार (डीएनए जोड़ वसूली के लिए तेजी से दृष्टिकोण) परख से ली गई है जिसका उपयोग इथेनॉल वर्षा द्वारा डीपीसी युक्त जीनोमिक डीएनए के अलगाव के लिए किया जाता है। सामान्यीकरण और न्यूक्लियस पाचन के बाद, डीपीसी के पीटीएम, जिसमें सर्वव्यापकता, सूमोनाइलेशन और एडीपी-राइबोसिलेशन शामिल हैं, को उनके संबंधित एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोब्लोटिंग द्वारा पता लगाया जाता है। इस मजबूत परख का उपयोग नए आणविक तंत्र ों की पहचान और विशेषता के लिए किया जा सकता है जो एंजाइमेटिक और गैर-एंजाइमेटिक डीपीसी की मरम्मत करते हैं और डीपीसी की मरम्मत के लिए पीटीएम को विनियमित करने वाले विशिष्ट कारकों को लक्षित करने वाले छोटे अणु अवरोधकों की खोज करने की क्षमता रखते हैं।
जीनोमिक डीएनए क्षति सहज क्षय, आंतरिक क्षति औरपर्यावरणीय कारकों के कारण होती है। परिणामस्वरूप डीएनए घावों में क्षतिग्रस्त आधार, बेमेल, एकल और डबल-स्ट्रैंड ब्रेक, अंतर-और इंट्रा-स्ट्रैंड क्रॉसलिंक और डीएनए-प्रोटीन क्रॉसलिंक (डीपीसी) शामिल हैं। एक डीपीसी तब बनता है जब एक क्रोमैटिन-बाध्य प्रोटीन सहसंयोजक लिंकेज के माध्यम से डीएनए पर फंस जाता है। डीपीसी अंतर्जात डीएनए घावों और प्रतिक्रियाशील मेटाबोलाइट्स के साथ-साथ बहिर्जात एजेंटों जैसे कि कीमोथेरेपी और द्विक्रियाशील क्रॉसलिंकिंग एजेंटों से प्रेरित होते हैं। कुछ परिस्थितियों में, एंजाइम डिसफंक्शन से डीपीसी2 का गठन भी हो सकता है। डीपीसी इंड्यूसर में विशाल अंतर के परिणामस्वरूप सहसंयोजक-बाध्य प्रोटीन की पहचान, गुणसूत्र क्षेत्र जहां डीपीसी का गठन होता है, प्रोटीन से जुड़े डीएनए की संरचना प्रकार, और प्रोटीन और डीएनए 2,3,4 के बीच सहसंयोजक लिंकेज की रासायनिक संपत्ति में अंतर होता है।
उनकी रासायनिक प्रकृति के आधार पर, डीपीसी को आम तौर पर दो समूहों में वर्गीकृत किया जाता है: एंजाइमेटिक डीपीसी और गैर-एंजाइमेटिक डीपीसी। कुछ एंजाइम जैसे टोपोइसोमेरेस, ग्लाइकोसिलेस, और मिथाइल / एसाइलट्रांसफेरेज़ अपनी सामान्य उत्प्रेरक प्रतिक्रियाओं के दौरान प्रतिवर्ती एंजाइम-डीएनए सहसंयोजक मध्यवर्ती बनाकर कार्य करते हैं। ये अल्पकालिक एंजाइम-डीएनए मध्यवर्ती हैं और अंतर्जात या बहिर्जात एजेंटों द्वारा उनके फंसने पर लंबे समय तक रहने वाले एंजाइमेटिक डीपीसी में परिवर्तित हो सकते हैं, विशेष रूप से कीमोथेरेपी3 द्वारा। टोपोइसोमेरेस डीपीसी यूकेरियोटिक कोशिकाओं में सबसे लगातार एंजाइमेटिक डीपीसी में से हैं, जिन्हें नैदानिक रूप से उपयोगी टोपोइसोमेरेस इनहिबिटर (टोपोइसोमेरेस आई [टॉप 1] के लिए टोपोटेकेन और इरिनोटेकन और टोपोइसोमेरेस II [टॉप 2] के लिए एटोपोसाइड और डॉक्सोर्यूबिसिन द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है) और इनअवरोधकों के प्राथमिक चिकित्सीय तंत्र हैं।. डीएनए मेथिलट्रांसफेरेज़ (डीएनएमटी) 1, 3 ए, और 3 बी 5-एज़ा-2′-डीऑक्सीसाइटिडाइन (जिसे डिसिटाबिन के रूप में भी जाना जाता है) का लक्ष्य हैं और दवा7 के संपर्क में आने पर डीपीसी बनाते हैं। प्रतिक्रियाशील एजेंट, साथ ही पराबैंगनी प्रकाश और आयनकारी विकिरण, गैर-विशेष रूप से डीएनए में क्रॉसलिंकिंग प्रोटीन द्वारा गैर-एंजाइमेटिक डीपीसी को प्रेरित करते हैं। एसीटैल्डिहाइड और फॉर्मलाडेहाइड (एफए) जैसे प्रतिक्रियाशील एल्डिहाइड अक्सर सेलुलर चयापचय के उपोत्पाद के रूप में उत्पन्न होते हैं, जिनके बीच एफए मेथनॉल चयापचय, लिपिड पेरोक्सीडेशन और हिस्टोन डिमिथाइलेशन के दौरान माइक्रोमोलर सांद्रता में उत्पादित होता है। इसके अलावा, एफए दुनिया भर में निर्मित एक उच्च मात्रा वाला उत्पादन रसायन है, जिसके लिए कई लोग पर्यावरण और व्यावसायिक रूप से 8,9 दोनों के संपर्क में हैं।
एंजाइमेटिक और गैर-एंजाइमेटिक डीपीसी दोनों कोशिकाओं के लिए अत्यधिक विषाक्त होते हैं क्योंकि उनके भारी प्रोटीन घटक प्रतिकृति और प्रतिलेखन सहित लगभग सभी क्रोमैटिन-आधारित प्रक्रियाओं में कुशलता पूर्वक बाधा डालते हैं, जिससे सेल चक्र गिरफ्तारी और एपोप्टोसिस होता है। पिछले दो दशकों में, डीपीसी की मरम्मत का सख्ती से अध्ययन किया गया है, और कई प्रोटीन / मार्गों को प्रमुख कारकों के रूप में पहचाना गया है जो या तो सीधे डीपीसी की मरम्मत करते हैं या उनकी मरम्मत प्रक्रियाओं को संशोधित करते हैं। उदाहरण के लिए, यह अच्छी तरह से स्थापित किया गया है कि डीपीसी के प्रोटीन थोक का प्रोटियोलिसिस डीपीसी मरम्मत का एक महत्वपूर्ण कदम है, और प्रोटियोलिसिस को प्रोटीज एसपीआरटीएन 10,11,12,13,14, FAM111A 15, जीसीएनए 16,17, या 26 एस प्रोटीसोम कॉम्प्लेक्स 18,19,20,21,22 द्वारा उत्प्रेरित किया जा सकता है।, 23,24,25,26,27 एक सेल प्रकार- या सेलुलर संदर्भ-निर्भर तरीके से। इन प्रोटीज की पहचान और लक्षण वर्णन काफी हद तक एंजाइम (आईसीई) परख28,29 के विवो कॉम्प्लेक्स और डीएनए जोड़ वसूली (रडार) परख30,31 के लिए तेजी से दृष्टिकोण पर निर्भर करता है, जो दोनों डीएनए अणुओं और उनके सहसंयोजक-बाध्य प्रोटीन को मुक्त सेलुलर प्रोटीन से अलग करते हैं ताकि क्रॉसलिंक्ड प्रोटीन को लक्षित करने वाले एंटीबॉडी का उपयोग करके स्लॉट-ब्लॉट द्वारा डीपीसी का पता लगाया जा सके। इसके अलावा, ट्रैप्ड-इन अगारोस डीएनए इम्यूनोस्टेनिंग (टीएआरडीआईएस) परख का उपयोग एकल-कोशिका स्तर32 पर डीपीसी का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के साधन के रूप में किया गया था। वर्तमान में, शोधकर्ता डीपीसी को मापने के लिए आईसीई परख पर रडार परख चुनते हैं, क्योंकि आईसीई परख सीज़ियम क्लोराइड ग्रेडिएंट अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके न्यूक्लिक एसिड के शुद्धिकरण पर निर्भर करती है, जो बेहद समय लेने वाली है, जबकि रडार परख बहुत कम अवधि के भीतर इथेनॉल का उपयोग करके न्यूक्लिक एसिड को अवक्षेपित करती है।
हाल के वर्षों में, बढ़ते सबूत सामने आए हैं कि डीपीसी-लक्षित प्रोटीज 3,33,34,35 के सिग्नलिंग और भर्ती में कई पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन (पीटीएम) शामिल हैं। उदाहरण के लिए, TOP1- और TOP2-DPC दोनों को छोटे यूबिकिटिन-जैसे संशोधक (SUMO)-2/3 और फिर SUMO-1 द्वारा SUMO E3 लिगेज PIAS4 द्वारा संयुग्मित पाया गया, जो डीएनए प्रतिकृति और प्रतिलेखन से स्वतंत्र था। अनुक्रमिक सूमो संशोधन यूबिकिटिन का लक्ष्य प्रतीत होते हैं, जिसे सूमोइलेटेड टीओपी-डीपीसी में जमा किया जाता है और आरएनएफ 4 नामक सूमो-लक्षित यूबिकिटिन लिगेज द्वारा अपने लाइसिन 48 अवशेषों के माध्यम से बहुलक श्रृंखला बनाता है। इसके बाद, यूबिकिटिन बहुलक 26 एस प्रोटीसम को टीओपी-डीपीसी23,36 में एक संकेत प्राप्त करता है और भर्ती करता है। उसी सूमो-यूबिकिटिन मार्ग को हाल ही में डीएनएमटी 1-डीपीसी के साथ-साथ पीएआरपी-डीएनए परिसरों पर उनकी मरम्मतके लिए 37,38 पर कार्य करने के लिए दिखाया गया था। इसके अलावा, यूबिकिटिन ई 3 लिगेज टीआरएपी द्वारा सूमो-स्वतंत्र सर्वव्यापकता को प्रतिकृति-युग्मिततरीके से प्रोटीसोमल गिरावट के लिए प्रमुख डीपीसी को सूचित किया गया है। टीओपी-डीपीसी के प्रोटीसोमल क्षरण के समान, प्रतिकृति-युग्मित मेटालोप्रोटीज एसपीआरटीएन द्वारा एंजाइमेटिक और गैर-एंजाइमेटिक डीपीसी के प्रोटियोलिसिस को भी एसपीआरटीएन40,41 को संलग्न करने के लिए एक तंत्र के रूप में डीपीसी सब्सट्रेट्स की सर्वव्यापकता की आवश्यकता होती है। सूमोनाइलेशन और सर्वव्यापकता की भूमिका के चित्रण के लिए उन डीपीसी का पता लगाने की आवश्यकता होती है जो इन पीटीएम के साथ चिह्नित हैं। चूंकि मूल आईसीई परख और रडार परख बिना पचे हुए डीएनए नमूनों को मापने के लिए स्लॉट-ब्लॉट/ डॉट-ब्लॉट उपकरण पर भरोसा करते हैं, इसलिए इन दोनों परखों में से कोई भी विभिन्न आणविक भार के साथ पीटीएम-संयुग्मित डीपीसी प्रजातियों को हल करने और कल्पना करने में सक्षम नहीं है। इस समस्या को दूर करने के लिए, हमने इथेनॉल वर्षा द्वारा उनके शुद्धिकरण के बाद डीएनए नमूनों को पचाया और क्रॉसलिंक्ड प्रोटीन को छोड़ने के लिए माइक्रोकोकल न्यूक्लियस, एक डीएनए और आरएनए एंडो-एक्सोन्यूक्लिज़ के साथ नमूना सामान्यीकरण, जिसने हमें प्रोटीन के साथ-साथ सोडियम डोडेसिल-सल्फेट पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस-पेज) के साथ उनके सहसंयोजक पीटीएम को हल करने में सक्षम बनाया। वैद्युतकणसंचलन ने हमें पीटीएम को लक्षित करने वाले विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके पीटीएम-संयुग्मित डीपीसी का पता लगाने और मात्रात्मक करने की अनुमति दी। हमने शुरू में इस बेहतर विधि को डस्ट परख नाम दिया, ताकि सर्वव्यापकता और सुमोइलेटेड टॉप-डीपीसी23 का पता लगाने में इसकी मजबूती को उजागर किया जा सके। बाद में, हमने पॉली-एडीपी-राइबोज पॉलिमर20 के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए, विवो में टीओपी 1-डीपीसी के एडीपी-राइबोसिलेशन का मात्रात्मक आकलन करने के लिए परख के उपयोग का विस्तार किया।
यहां प्रस्तुत परख के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल है जो सर्वव्यापक, सूमोइलेटेड और एडीपी-राइबोसिलेटेड डीपीसी का पता लगाता है और मापता है, जिसे संशोधित टीओपी-डीपीसी के लिए अनुकूलित किया गया था जो उनके अवरोधकों और गैर-विशिष्ट / गैर-एंजाइमेटिक डीपीसी द्वारा प्रेरित होते हैं जो एफए द्वारा प्रेरित होते हैं। यह परख पीटीएम-संयुग्मित डीपीसी को एक कोट्रोपिक एजेंट के साथ कोशिकाओं को लाइज करके, इथेनॉल के साथ डीएनए को अवक्षेपित करके और अन्यथा क्रॉसलिंक्ड प्रोटीन और माइक्रोकोकल न्यूक्लियस के साथ उनके संशोधक जारी करके अलग करती है। अन्यथा डीएनए-बाध्य प्रोटीन और उनके पीटीएम को विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोब्लोटिंग द्वारा निर्धारित किया जाता है। यह परख आणविक तंत्र को स्पष्ट करने के लिए एक नया मार्ग प्रशस्त करती है जिसके द्वारा कोशिका एंजाइमैटिक और गैर-एंजाइमेटिक डीपीसी दोनों की मरम्मत करती है। विशेष रूप से, यह टीओपी-डीपीसी गिरावट और मरम्मत के विनियमन के लिए महत्वपूर्ण पीटीएम के प्रेरण और कैनेटीक्स के विस्तृत अध्ययन को सक्षम बनाता है, और इस प्रकार पीटीएम को निर्देशित करने वाले ई 3 लिगास जैसे नए कारकों की खोज की अनुमति देता है। साथ ही इन कारकों को लक्षित करने वाले अवरोधक। चूंकि टीओपी-डीपीसी मरम्मत के लिए जिम्मेदार कुछ पीटीएम संभवतः प्लैटिनम-आधारित दवाओं22 जैसे अन्य कीमोथेरेपी द्वारा प्रेरित डीपीसी की मरम्मत में शामिल हैं, इसलिए इस परख में नई दवाओं की खोज और उपचार आहार का मार्गदर्शन करने के लिए रोगी कोशिकाओं में टोपोइसोमेरेस इनहिबिटर या प्लैटिनम-आधारित एंटीनोप्लास्टिक्स के साथ मिश्रित उपचारों के तर्कसंगत अनुकूलन के लिए आवेदन की क्षमता भी है।
वर्णित विधि स्तनधारी कोशिकाओं में एंजाइमेटिक और गैर-एंजाइमेटिक डीएनए-प्रोटीन क्रॉसलिंक के माप की अनुमति देती है और उनकी सर्वव्यापकता, सूमोनाइलेशन और एडीपी-राइबोसिलेशन का अध्ययन करने के लिए एकमात्र उपयुक्त दृष्टिकोण है। आईसीई या रडार परख के बाद स्लॉट-ब्लॉटिंग अपने एंटीबॉडी का उपयोग करके टॉप-डीपीसी जैसे विशिष्ट एंजाइमेटिक डीपीसी का तेजी से पता लगाने की अनुमति देता है। हालांकि, इस विधि के लिए एक चेतावनी विभिन्न आणविक भार के प्रोटीन को अलग करने में असमर्थता है, जिससे पीटीएम-संयुग्मित डीपीसी के आकार को निर्धारित करना असंभव हो जाता है। वर्णित विधि माइक्रोकोकल न्यूक्लियस के साथ क्रॉसलिंक्ड प्रोटीन जारी करके समस्या को हल करती है, जो डीएनए को टर्मिनल 3′-फॉस्फेट के साथ ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स में नीचा दिखाती है, जिससे एसडीएस-पेज द्वारा प्रोटीन (ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के साथ संयुग्मित) के पूर्ण पृथक्करण की अनुमति मिलती है। यूबिकिटिन, सूमो, या एडीपी-राइबोज मोनोमर्स और विभिन्न आकारों के पॉलिमर के साथ संशोधित डीपीसी को इसलिए इन पीटीएम को लक्षित करने वाले एंटीबॉडी द्वारा कल्पना और मात्रा निर्धारित की जा सकती है, जिससे उनके गठन और कैनेटीक्स की विस्तृत जांच हो सकती है। प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने और सांख्यिकीय महत्व की गणना करने के लिए, प्रयोगों की जैविक प्रतिकृति की आवश्यकता होती है।
इस परख की सबसे आम समस्याओं में से एक इथेनॉल वर्षा के बाद कम डीएनए उपज है। एक तरफ, डीएनए उपज को अधिक शुरुआती सामग्री (कोशिकाओं) के साथ बढ़ाया जा सकता है। दूसरी ओर, एक एपेंडॉर्फ ट्यूब के बजाय एक फ्लैट प्लेट में इथेनॉल के साथ इनक्यूबेटिंग सेल लाइसेट डीएनए अणुओं के एकत्रीकरण में स्पष्ट रूप से सुधार कर सकते हैं और इस प्रकार उनकी वर्षा की सुविधा प्रदान कर सकते हैं। दवा उपचार के बिना नमूनों में देखे गए गैर-विशिष्ट संकेत गैर-सहसंयोजक प्रोटीन संदूषण का संकेत दे सकते हैं। यदि यह मामला है, तो सोनिकेशन से पहले दूषित पदार्थों को हटाने के लिए उच्च नमक बफर के साथ डीएनए छर्रों को धोने पर विचार किया जा सकता है। सोनिकेशन और माइक्रोकोकल न्यूक्लियस पाचन के बाद डीएनए नमूनों को स्पिन करने और किसी भी अघुलनशील को त्यागने की भी सिफारिश की जाती है। खराब या कोई संकेत नहीं होने के मामले में, कई संभावित समाधानों का प्रयास किया जा सकता है। सबसे पहले, कोई एसडीएस-पेज और इम्यूनोब्लोटिंग के लिए डीएनए की लोडिंग राशि बढ़ा सकता है। सूमोइलेटेड और सर्वव्यापी डीपीसी प्रजातियों का पता लगाने योग्य बनाने के लिए, जेल पर कम से कम 4 μg डीएनए लोड करने की सिफारिश की जाती है। दूसरा, डीपीसी और उनके संबंधित पीटीएम के उच्च स्तर को प्रेरित करने के लिए दवा सांद्रता को बढ़ाया जा सकता है। तीसरा, यह सुझाव दिया जाता है कि यदि बैंड / स्मीयर कमजोर दिखाई देते हैं तो एक और दिन के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ धब्बों को इनक्यूबेट करें। 2-दिवसीय इनक्यूबेशन सिग्नल को काफी शक्तिशाली बना सकता है और इस प्रकार स्वतंत्र प्रयोगों से जैविक परिवर्तनशीलता को कम कर सकताहै। पुन: धुंधला करने के लिए झिल्ली स्ट्रिपिंग अनिवार्य रूप से पीटीएम-संयुग्मित डीपीसी प्रजातियों की एक निश्चित मात्रा के नुकसान का परिणाम है जो पहले से ही कम बहुतायत में हैं। इसलिए, एक धब्बे की फिर से जांच करने के बजाय यूबिकिटिन और सूमो का पता लगाने के लिए अलग-अलग जैल चलाने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है। इसके अलावा, डीएनए छर्रों को एच 2 ओ या किसी अन्य सॉल्वैंट्स में विघटन से पहले गुआनिडाइन नमक युक्त शेष डीएनएज़ोल को हटाने के लिए 75% इथेनॉल के साथ धोया जाना चाहिए, जो अन्यथा लैम्मली लोडिंग बफर के अतिरिक्त नमूने के क्रिस्टलीकरण का कारण बनता है।
वर्णित विधि का वर्कफ़्लो बोझिल आईसीई परख की तुलना में बहुत अधिक समय-कुशल है, क्योंकि यह जीनोमिक डीएनए को अलग करने के लिए समय लेने वाले सीज़ियम क्लोराइड अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के बजाय तेजी से इथेनॉल वर्षा पर निर्भर करता है। एक कीमत पर, इथेनॉल-आधारित शुद्धिकरण प्रोटीन दूषित पदार्थों की कम मात्रा लाता है जो आमतौर पर इम्यूनोडिटेक्शन के लिए नगण्य होते हैं। हालांकि, जब विश्लेषणात्मक अध्ययनों की बात आती है, जैसे कि मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित प्रोटिओमिक विश्लेषण या अगली पीढ़ी के अनुक्रमण जिन्हें सटीकता और परिशुद्धता की आवश्यकता होती है, तो सीज़ियम-क्लोराइड घनत्व-ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन अभी भी शुद्ध, उच्च-बहुतायत डीएनए को अलग करने के लिए एक अधिक विश्वसनीय दृष्टिकोण है। इस विधि को संभावित रूप से क्रॉसलिंक्ड प्रोटीन पर संशोधन साइटों की रूपरेखा और उचित मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित विधियों का उपयोग करके पॉली-सर्वव्यापकता और पॉली-सूमोनाइलेशन के लिंकेज प्रकारों के निर्धारण के लिए भी लागू किया जा सकता है।
ध्यान दें, यह परख डीपीसी की मरम्मत के लिए पीटीएम को विनियमित करने वाले कारकों की पहचान और लक्षण वर्णन की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, निष्पक्ष उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग विधियां (आरएनए हस्तक्षेप और सीआरआईएसपीआर) यूबिकिटिन ई 3 लिगैस, सूमो ई 3 लिगेस और उनके संबंधित कोफ़ैक्टर्स की खोज करने के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं जो डीपीसी इंड्यूसर ्स की साइटोटॉक्सिसिटी को कम करते हैं। वर्णित विधि यह निर्धारित करके इन प्रोटीनों के आणविक सत्यापन को सक्षम बनाती है कि क्या वे डीपीसी की मरम्मत करके कोशिकाओं को डीपीसी इंड्यूसर से बचने में मदद करते हैं। यह देखते हुए कि टोपोइसोमेरेस इनहिबिटर सबसे अधिक निर्धारित कीमोथेरेपी में से हैं, इस मजबूत परख को दवाओं के विकास के लिए एक उपकरण के रूप में विकसित किया जा सकता है जो नैदानिक टोपोइसोमेरेस इनहिबिटर के साथ तालमेल करते हैं।
The authors have nothing to disclose.
यह काम पोस्टडॉक्टरल रिसर्च ट्रांजिशन अवार्ड में नेशनल कैंसर इंस्टीट्यूट सेंटर फॉर कैंसर रिसर्च एक्सीलेंस द्वारा समर्थित था।
10x Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher | 70011069 | |
4–20% precast polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561096 | |
4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
AcquaStain (coomassie blue) | Bulldog Bio | AS001000 | |
anti-dsDNA (mouse monoclonal) | Abcam | 27156 | 1: 5,000 dilution is recommended |
anti-PAR (mouse monoclonal) | R&D systems | 4335-MC-100 | 1: 500 dilution is recommended |
anti-SUMO-1(rabbit monoclonal) | Cell Signaling Technology | 4940 | 1: 250 dilution is recommended |
anti-SUMO-2/3 (rabbit monoclonal) | Cell Signaling Technology | 4971 | 1: 250 dilution is recommended |
anti-TOP1 (mouse monoclonal) | BD Biosciences | 556597 | 1: 500 dilution is recommended |
anti-TOP2α (mouse monoclonal) | Santa Cruz Biotechnology | SC-365799 | 1: 250 dilution is recommended |
anti-TOP2β (mouse monoclonal) | Santa Cruz Biotechnology | SC-25330 | 1: 250 dilution is recommended |
anti-ubiquitin (mouse monoclonal) | Santa Cruz Biotechnology | SC-8017 | 1: 100 dilution is recommended |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 499609 | Used for micrococcal nuclease digestion |
Camptothecin | Sigma-Aldrich | PHL89593 | |
ChemiDo MP imaging system | Bio-Rad | 12003154 | |
Disodium phosphate | Sigma-Aldrich | 5438380100 | Used to make sodium phosphate buffer |
DNAzol | Thermo Fisher | 10503027 | |
DTT (dithiothreitol) | Thermo Fisher | R0861 | |
Dulbecco's modified eagle's medium | Sigma-Aldrich | 11965084 | |
Ethyl alcohol, 200 proof | Sigma-Aldrich | E7023 | |
Etoposide | Sigma-Aldrich | 1268808 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 47608 | |
Graphpad Prism Software | GraphStats | Prism 9.0.0 | |
HRP-linked Mouse IgG | Cytiva | NA931 | 1: 5,000 dilution is recommended |
HRP-linked Rabbit IgG | Cytiva | NA934 | 1: 5,000 dilution is recommended |
ImageJ Software | NIH, USA | ImageJ 1.53e | |
L-Glutamine | Fisher Scientific | 25030081 | |
Maximum sensitivity ECL substrate | Thermo Fisher | 34095 | |
Micrococcal nuclease | New England BioLabs | M0247S | |
Monosodium phosphate | Sigma-Aldrich | S3139 | Used to make sodium phosphate buffer |
NanoDrop 2000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | |
N-ethylmaleimide | Thermo Fisher | 23030 | DeSUMOylation/deubiquitylation inhibitor |
Nitrocellulose membrane, 0.45 µm | Bio-Rad | 1620115 | |
Non-fat dry milk | Bio-Rad | 1706404XTU | |
PDD00017273 | Selleckchem | S8862 | Poly(ADP-ribose) glycohydrolase inhibitor |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
Protease inhibitor cocktail | Thermo Fisher | 78430 | |
Q700 sonicator | Qsonica | Q700-110 | |
Ready-to-assemble PVDF transfer kit | Bio-Rad | 1704274 | |
Slot-blot apparatus | Bio-Rad | 1706542 | |
Slot-blot filter paper | Bio-Rad | 1620161 | |
Trans-Blot turbo transfer system | Bio-Rad | 1704150 | |
Tris/Glycine/SDS electrophoresis buffer | Bio-Rad | 1610732 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P3179 | |
Vertical electrophoresis cell | Bio-Rad | 1658004 |