Detta protokoll belyser en modifierad metod för att detektera och kvantifiera DNA-proteintvärbindningar (DPC) och deras posttranslationella modifieringar (PTM), inklusive ubiquitylering, SUMOylering och ADP-ribosylering inducerad av topoisomerashämmare och av formaldehyd, vilket möjliggör studier av bildning och reparation av DPC och deras PTM.
DNA-proteintvärbindningar (DPC) är frekventa, allestädes närvarande och skadliga DNA-lesioner, som uppstår på grund av endogena DNA-skador, enzym (topoisomeraser, metyltransferaser, etc.) som inte fungerar som de ska, eller exogena medel som kemoterapeutiska medel och tvärbindningsmedel. När DPC:er väl har inducerats konjugeras flera typer av posttranslationella modifieringar (PTM) omedelbart till dem som mekanismer för tidig respons. Det har visats att DPC:er kan modifieras av ubiquitin, liten ubiquitin-liknande modifierare (SUMO) och poly-ADP-ribos, som förbereder substraten för att signalera sina respektive utsedda reparationsenzymer och, i vissa fall, koordinerar reparationen på sekventiella sätt. Eftersom PTM transpirerar snabbt och är mycket reversibla har det varit utmanande att isolera och detektera PTM-konjugerade DPC:er som vanligtvis ligger kvar på låga nivåer. Här presenteras en immunanalys för att rena och kvantitativt detektera ubiquitylerade, SUMOylerade och ADP-ribosylerade DPC:er (läkemedelsinducerade topoisomeras DPC:er och aldehydinducerade icke-specifika DPC:er) in vivo. Denna analys härrör från RADAR-analysen (rapid approach to DNA adduct recovery) som används för isolering av genomiskt DNA som innehåller DPC genom etanolutfällning. Efter normalisering och nukleasnedbrytning detekteras PTM av DPC, inklusive ubiquitylering, SUMOylering och ADP-ribosylering, genom immunoblot med hjälp av motsvarande antikroppar. Denna robusta analys kan användas för att identifiera och karakterisera nya molekylära mekanismer som reparerar enzymatiska och icke-enzymatiska DPC:er och har potential att upptäcka småmolekylära hämmare som riktar sig mot specifika faktorer som reglerar PTM för att reparera DPC.
Genomisk DNA-skada uppstår på grund av spontant förfall, inre skador och miljöfaktorer1. De resulterande DNA-skadorna består av skadade baser, missmatchningar, enkel- och dubbelsträngsbrott, tvärbindningar mellan och inom strängar och DNA-proteintvärbindningar (DPC). En DPC bildas när ett kromatinbundet protein fångas på DNA genom kovalent bindning. DPC induceras av endogena DNA-lesioner och reaktiva metaboliter, såväl som exogena medel såsom kemoterapeutiska och bifunktionella tvärbindningsmedel. Under vissa omständigheter kan enzymdysfunktion också leda till bildandet av DPC2. Den stora skillnaden i DPC-inducerare resulterar i en skillnad i identiteten hos det kovalent bundna proteinet, kromosomregionen där DPC bildas, strukturtypen för DNA som tvärbinds till proteinet och den kemiska egenskapen hos den kovalenta bindningen mellan proteinet och DNA 2,3,4.
Baserat på deras kemiska natur kategoriseras DPC:er i allmänhet i två grupper: enzymatiska DPC:er och icke-enzymatiska DPC:er. Vissa enzymer såsom topoisomeraser, glykosylaser, och metyl/acyltransferaser verkar genom att bilda reversibla enzym-DNA-kovalenta intermediärer under deras normala katalytiska reaktioner. Dessa är kortlivade enzym-DNA-intermediärer och kan omvandlas till långlivade enzymatiska DPC när de fångas av endogena eller exogena agens, särskilt genom kemoterapeutiska3. Topoisomeras DPC är bland de vanligaste enzymatiska DPC:erna i eukaryota celler, vilka kan genereras av kliniskt användbara topoisomerashämmare (topotekan och irinotekan för topoisomeras I [TOP1] och etoposid och doxorubicin för topoisomeras II [TOP2]) och är de primära terapeutiska mekanismerna för dessa hämmare 5,6. DNA-metyltransferaser (DNMT) 1, 3A och 3B är målet för 5-aza-2′-deoxicytidin (även känd som decitabin) och bildar DPC vid exponering för läkemedlet7. Reaktiva ämnen, såväl som ultraviolett ljus och joniserande strålning, inducerar icke-enzymatiska DPC:er genom att icke-specifikt tvärbinda proteiner till DNA. Reaktiva aldehyder som acetaldehyd och formaldehyd (FA) genereras ofta som biprodukter av cellulära metabolismer, bland vilka FA produceras vid mikromolära koncentrationer under metanolmetabolism, lipidperoxidation och histondemetylering. Dessutom är FA en högvolymproduktionskemikalie som tillverkas över hela världen, som många människor exponeras för både miljömässigt och yrkesmässigt 8,9.
Både enzymatiska och icke-enzymatiska DPC:er är mycket giftiga för celler eftersom deras skrymmande proteinkomponenter effektivt hindrar nästan alla kromatinbaserade processer, inklusive replikation och transkription, vilket leder till cellcykelstopp och apoptos om de lämnas oreparerade. Under de senaste två decennierna har reparationen av DPC:er studerats kraftigt, och flera proteiner/signalvägar har identifierats som nyckelfaktorer som antingen direkt reparerar DPC:er eller modulerar deras reparationsprocesser. Till exempel har det varit väl etablerat att proteolys av proteinmassan i en DPC är ett avgörande steg för DPC-reparation, och att proteolys kan katalyseras av proteaserna SPRTN 10,11,12,13,14, FAM111A15, GCNA 16,17 eller 26S-proteasomkomplexet 18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27 på ett celltyps- eller cellulärt kontextberoende sätt. Identifiering och karakterisering av dessa proteaser har till stor del förlitat sig på in vivo-komplexet i enzymet (ICE) -analysen28,29 och den snabba metoden för DNA-adduktåterhämtning (RADAR) -analys30,31, som båda isolerar DNA-molekyler och deras kovalent bundna proteiner från fria cellulära proteiner för att möjliggöra detektion av DPC genom slot-blot med hjälp av antikroppar riktade mot de tvärbundna proteinerna. Dessutom användes TARDIS-analysen (Trapped-in agarose DNA immunostaining) som ett sätt att detektera och kvantifiera DPC på encellsnivå32. För närvarande väljer forskare RADAR-analysen framför ICE-analysen för att mäta DPC, eftersom ICE-analysen bygger på rening av nukleinsyror med hjälp av cesiumkloridgradientultracentrifugering, vilket är extremt tidskrävande, medan RADAR-analysen fäller ut nukleinsyror med etanol inom en mycket kortare period.
Under de senaste åren har det framkommit allt fler bevis för att flera posttranslationella modifieringar (PTM) är involverade i signalering och rekrytering av DPC-riktade proteaser 3,33,34,35. Till exempel visade sig både TOP1- och TOP2-DPCs vara konjugerade av liten ubiquitin-liknande modifierare (SUMO)-2/3 och sedan SUMO-1 av SUMO E3-ligaset PIAS4, oberoende av DNA-replikation och transkription. De sekventiella SUMO-modifieringarna verkar vara ett mål för ubiquitin, som deponeras till SUMOylated TOP-DPCs och bildar polymera kedjor genom dess lysin 48-rest av ett SUMO-riktat ubiquitinligas som kallas RNF4. Därefter framkallar ubiquitinpolymeren en signal till och rekryterar 26S-proteasomen till TOP-DPCs23,36. Samma SUMO-ubiquitin-väg visade sig nyligen verka på DNMT1-DPC såväl som PARP-DNA-komplex för deras reparation37,38. Dessutom har SUMO-oberoende ubiquitylering av ubiquitin E3-ligaset TRAIP rapporterats prima DPC för proteasomal nedbrytning på ett replikationskopplat sätt39. I likhet med den proteasomala nedbrytningen av TOP-DPC, kräver proteolys av enzymatiska och icke-enzymatiska DPC:er med det replikationskopplade metalloproteas-SPRTN också ubiquitylering av DPC-substraten som en mekanism för att engagera SPRTN40,41. Avgränsning av SUMOyleringens och ubiquityleringens roll kräver detektering av DPC:er som är märkta med dessa PTM:er. Eftersom den ursprungliga ICE-analysen och RADAR-analysen förlitar sig på slot-blot/dot-blot-apparat för att mäta osmälta DNA-prover, kan ingen av dessa två analyser upplösa och visualisera PTM-konjugerade DPC-arter med olika molekylvikter. För att övervinna detta problem smälte vi DNA-proverna efter deras rening genom etanolutfällning och provnormalisering med mikrokocknukleas, ett DNA- och RNA-endo-exonukleas för att frigöra de tvärbundna proteinerna, vilket gjorde det möjligt för oss att lösa upp proteinerna såväl som deras kovalenta PTM med natriumdodecyl-sulfatpolyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE). Elektroforesen gjorde det möjligt för oss att detektera och kvantifiera PTM-konjugerade DPC:er med hjälp av specifika antikroppar riktade mot PTM:erna. Vi döpte ursprungligen denna förbättrade metod till DUST-analysen, för att betona dess robusthet vid detektion av ubiquitylerade och SUMOylerade TOP-DPCs23. Senare utökade vi användningen av analysen för att kvantitativt bedöma ADP-ribosylering av TOP1-DPCs in vivo, med hjälp av antikroppar mot poly-ADP-ribospolymerer20.
Här presenteras ett detaljerat protokoll för analysen som detekterar och mäter ubiquitylerade, SUMOylerade och ADP-ribosylerade DPC:er, som optimerades för de modifierade TOP-DPC:erna som induceras av deras hämmare och icke-specifika/icke-enzymatiska DPC:er som induceras av FA. Denna analys isolerar PTM-konjugerade DPC:er genom att lysera celler med ett kaotropiskt medel, fälla ut DNA med etanol och frigöra de annars tvärbundna proteinerna och deras modifierare med mikrokocknukleas. De annars DNA-bundna proteinerna och deras PTM kvantifieras genom immunoblot med hjälp av specifika antikroppar. Denna analys banar en ny väg för att belysa de molekylära mekanismerna genom vilka cellen reparerar både enzymatiska och icke-enzymatiska DPC. Specifikt möjliggör den detaljerade studier av induktion och kinetik hos PTM:er som är viktiga för regleringen av TOP-DPC-nedbrytning och reparation, och möjliggör därmed upptäckten av nya faktorer såsom E3-ligaser som dikterar PTM:erna, samt inhibitorer som riktar sig mot dessa faktorer. Eftersom några av de PTM:er som ansvarar för TOP-DPC-reparation sannolikt är involverade i reparation av DPC inducerade av andra kemoterapeutiska läkemedel, såsom platinabaserade läkemedel22, har denna analys också potential för tillämpning på upptäckten av nya läkemedel och rationell optimering av kombinatoriska terapier med topoisomerashämmare eller platinabaserade antineoplaster i patientceller för att vägleda behandlingsregimer.
Den beskrivna metoden möjliggör mätning av enzymatiska och icke-enzymatiska DNA-proteintvärbindningar i däggdjursceller och är den enda lämpliga metoden för att studera deras ubiquitylering, SUMOylering och ADP-ribosylering. Slot-blotting efter ICE- eller RADAR-analysen möjliggör snabb detektion av specifika enzymatiska DPC:er såsom TOP-DPCs med hjälp av deras antikroppar. En invändning mot denna metod är dock dess oförmåga att separera proteiner med olika molekylvikter, vilket gör det omöjligt att bestämma storleken på PTM-konjugerade DPC:er. Den beskrivna metoden löser problemet genom att frisätta tvärbundna proteiner med mikrokocknukleas, vilket bryter ned DNA till oligonukleotider med terminala 3′-fosfater, vilket möjliggör fullständig separation av proteinerna (konjugerade med oligonukleotider) med SDS-PAGE. DPC:er modifierade med ubiquitin-, SUMO- eller ADP-ribosmonomerer och polymerer av olika storlekar kan därför visualiseras och kvantifieras av antikroppar riktade mot dessa PTM, vilket möjliggör detaljerad undersökning av deras bildning och kinetik. För att säkerställa reproducerbarhet och beräkna statistisk signifikans krävs biologiska replikat av experimenten.
Ett av de vanligaste problemen med denna analys är lågt DNA-utbyte efter etanolutfällning. Å ena sidan kan DNA-utbytet ökas med mer utgångsmaterial (celler). Å andra sidan kan inkubering av celllysat med etanol i en platt platta i stället för ett Eppendorfrör markant förbättra aggregeringen av DNA-molekyler och därmed underlätta deras utfällning. Ospecifika signaler som observerats i prover utan läkemedelsbehandling kan tyda på icke-kovalent proteinkontaminering. Om så är fallet, man kan överväga att tvätta DNA-pellets med hög saltbuffert för att avlägsna föroreningarna före ultraljudsbehandling. Det rekommenderas också att spinna ner DNA-prover efter ultraljudsbehandling och mikrokocknukleas matsmältning och kassera alla olösliga. Vid dålig eller ingen signal kan flera potentiella lösningar prövas. För det första kan man öka mängden DNA för SDS-PAGE och immunoblot. För att göra SUMOylerade och ubiquitylerade DPC-arter detekterbara rekommenderas att minst 4 μg DNA laddas på gelen. För det andra kan man öka läkemedelskoncentrationerna för att inducera högre nivåer av DPC och deras associerade PTM. För det tredje föreslås det att man inkuberar fläckar med primära antikroppar i ytterligare en dag om band/utstryk verkar vara svaga. En 2-dagars inkubation kan avsevärt potentiera signalen och därmed minska den biologiska variabiliteten från oberoende experiment23. Membranstrippning för omfärgning resulterar oundvikligen i förlust av en viss mängd PTM-konjugerade DPC-arter som redan finns i låg förekomst. Därför rekommenderas det starkt att köra separata geler för ubiquitin- och SUMO-detektion snarare än att undersöka en blot på nytt. Dessutom måste DNA-pellets tvättas med 75 % etanol för att avlägsna det återstående DNAzol-innehållande guanidinsaltet före upplösning i H2O eller andra lösningsmedel, vilket annars orsakar kristallisation av provet efter tillsats av Laemmli laddningsbuffert.
Arbetsflödet för den beskrivna metoden är mycket mer tidseffektivt jämfört med den besvärliga ICE-analysen, eftersom den förlitar sig på snabb etanolutfällning istället för den tidskrävande cesiumkloridultracentrifugeringen för att isolera genomiskt DNA. Etanolbaserad rening ger ett pris på en låg mängd proteinföroreningar som normalt är försumbara för immundetektion. Men när det gäller analytiska studier, såsom masspektrometribaserad proteomikanalys eller nästa generations sekvensering som kräver noggrannhet och precision, är cesium-kloriddensitetsgradientcentrifugering fortfarande en mer tillförlitlig metod för att isolera rent DNA med hög förekomst. Denna metod kan också potentiellt tillämpas på profilering av modifieringsställen på tvärbundna proteiner och bestämning av kopplingstyper av poly-ubiquitylering och poly-SUMOylering med hjälp av lämpliga masspektrometribaserade metoder.
Observera att denna analys möjliggör identifiering och karakterisering av faktorer som reglerar PTM för reparation av DPC:er. Till exempel är opartiska screeningmetoder med hög genomströmning (RNA-interferens och CRISPR) kraftfulla verktyg för att upptäcka ubiquitin E3-ligaser, SUMO E3-ligaser och deras associerade kofaktorer som minskar cytotoxiciteten hos DPC-inducerare. Den beskrivna metoden möjliggör molekylär validering av dessa proteiner genom att avgöra om de hjälper celler att överleva DPC-inducerare genom att reparera DPC:erna. Nya småmolekylära hämmare riktade mot dessa proteiner som identifierats, till exempel genom virtuell screening, kan också valideras med hjälp av detta protokoll. Med tanke på att topoisomerashämmare är bland de mest förskrivna kemoterapierna kan denna robusta analys utvecklas som ett verktyg för utveckling av läkemedel som synergiserar med kliniska topoisomerashämmare.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes delvis av National Cancer Institute Center for Cancer ResearchExcellence in Postdoctoral Research Transition Award.
10x Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher | 70011069 | |
4–20% precast polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561096 | |
4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
AcquaStain (coomassie blue) | Bulldog Bio | AS001000 | |
anti-dsDNA (mouse monoclonal) | Abcam | 27156 | 1: 5,000 dilution is recommended |
anti-PAR (mouse monoclonal) | R&D systems | 4335-MC-100 | 1: 500 dilution is recommended |
anti-SUMO-1(rabbit monoclonal) | Cell Signaling Technology | 4940 | 1: 250 dilution is recommended |
anti-SUMO-2/3 (rabbit monoclonal) | Cell Signaling Technology | 4971 | 1: 250 dilution is recommended |
anti-TOP1 (mouse monoclonal) | BD Biosciences | 556597 | 1: 500 dilution is recommended |
anti-TOP2α (mouse monoclonal) | Santa Cruz Biotechnology | SC-365799 | 1: 250 dilution is recommended |
anti-TOP2β (mouse monoclonal) | Santa Cruz Biotechnology | SC-25330 | 1: 250 dilution is recommended |
anti-ubiquitin (mouse monoclonal) | Santa Cruz Biotechnology | SC-8017 | 1: 100 dilution is recommended |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 499609 | Used for micrococcal nuclease digestion |
Camptothecin | Sigma-Aldrich | PHL89593 | |
ChemiDo MP imaging system | Bio-Rad | 12003154 | |
Disodium phosphate | Sigma-Aldrich | 5438380100 | Used to make sodium phosphate buffer |
DNAzol | Thermo Fisher | 10503027 | |
DTT (dithiothreitol) | Thermo Fisher | R0861 | |
Dulbecco's modified eagle's medium | Sigma-Aldrich | 11965084 | |
Ethyl alcohol, 200 proof | Sigma-Aldrich | E7023 | |
Etoposide | Sigma-Aldrich | 1268808 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 47608 | |
Graphpad Prism Software | GraphStats | Prism 9.0.0 | |
HRP-linked Mouse IgG | Cytiva | NA931 | 1: 5,000 dilution is recommended |
HRP-linked Rabbit IgG | Cytiva | NA934 | 1: 5,000 dilution is recommended |
ImageJ Software | NIH, USA | ImageJ 1.53e | |
L-Glutamine | Fisher Scientific | 25030081 | |
Maximum sensitivity ECL substrate | Thermo Fisher | 34095 | |
Micrococcal nuclease | New England BioLabs | M0247S | |
Monosodium phosphate | Sigma-Aldrich | S3139 | Used to make sodium phosphate buffer |
NanoDrop 2000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | |
N-ethylmaleimide | Thermo Fisher | 23030 | DeSUMOylation/deubiquitylation inhibitor |
Nitrocellulose membrane, 0.45 µm | Bio-Rad | 1620115 | |
Non-fat dry milk | Bio-Rad | 1706404XTU | |
PDD00017273 | Selleckchem | S8862 | Poly(ADP-ribose) glycohydrolase inhibitor |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
Protease inhibitor cocktail | Thermo Fisher | 78430 | |
Q700 sonicator | Qsonica | Q700-110 | |
Ready-to-assemble PVDF transfer kit | Bio-Rad | 1704274 | |
Slot-blot apparatus | Bio-Rad | 1706542 | |
Slot-blot filter paper | Bio-Rad | 1620161 | |
Trans-Blot turbo transfer system | Bio-Rad | 1704150 | |
Tris/Glycine/SDS electrophoresis buffer | Bio-Rad | 1610732 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P3179 | |
Vertical electrophoresis cell | Bio-Rad | 1658004 |